周 晶，歐陽怡，徐 倩，吳鴻飛

(1.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥 230012)

黃芩苷是唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根莖中提取分離出的一種黃酮類化合物，具抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫功能等藥理作用[1]。黃芩苷對乙型病毒性肝炎病毒的3種抗原有明顯抑制作用[2]，對慢性乙型病毒性肝炎并發(fā)癥有治療效果[3]。黃芩苷已被廣泛用于治療急慢性肝炎，療效確切[4]。但由于黃芩苷水溶性差、生物利用度低，限制了其臨床應(yīng)用。

固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles, SLN)是以體內(nèi)生物相容性較好，可生物降解的天然或合成類脂作為載藥材料，將藥物吸附或包裹在脂質(zhì)核中，形成粒徑為10～1 000 nm的納米顆粒[5]。黃芩苷制備成SLN，可提高黃芩苷的生物利用度[6]。

為擴展黃芩苷的臨床應(yīng)用，本實驗選用單硬脂酸甘油酯、膽固醇混合脂質(zhì)作為載藥材料制備黃芩苷-SLN分散液，并將黃芩苷-SLN分散液制成黃芩苷-SLN凍干粉。通過小鼠體內(nèi)組織分布實驗，比較黃芩苷-SLN凍干粉混懸液和黃芩苷混懸液在小鼠體內(nèi)的分布特性，為黃芩苷-SLN的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 試藥 黃芩苷(純度為85.94%，批號 141201)：四川省玉鑫藥業(yè)有限公司；黃芩苷對照品(純度≥98%，批號 110715-201312)、蘆丁對照品(純度≥98%，批號 100080-201406)：中國食品藥品檢定研究院；單硬脂酸甘油酯(批號 Y05A8S41269)、膽固醇(批號 L29N8F49258)：上海源葉生物科技有限公司；聚乙二醇400(批號 30150828)：國藥集團化學試劑有限公司；磷脂(批號 20150365)：合肥沃森生物科技有限公司；其余試劑為化學純或分析純。

1.2 儀器 UV-250紫外-可見分光光度計：日本島津公司；BXXW-LGJ-10真空冷凍干燥機：北京市博翔興旺科技發(fā)展有限公司；Nicolet 380型傅里葉變換紅外光譜：美國Nicolet公司；DSC204差示掃描量熱儀：德國Netzsth公司；Zetasizer 3000HS型粒徑測定儀：英國馬爾文公司；JEM-2100F型透射電子顯微鏡：日本電子株式會社；Agilent 1260型高效液相色譜儀：美國安捷倫有限公司。

1.3 實驗動物 昆明種普通級雄性小白鼠，體質(zhì)量(20±2)g。實驗動物均由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心[生產(chǎn)許可證：SCXK(皖)2017-0001]提供。

2 方法

2.1 黃芩苷-SLN分散液的制備 乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備黃芩苷-SLN分散液[7]。精密稱取黃芩苷5.0 mg、單硬脂酸甘油酯25.0 mg、膽固醇25.0 mg、磷脂50.0 mg，溶于10 mL無水乙醇中，于72 ℃恒溫水浴中加熱使其充分溶解，構(gòu)成有機相。精密稱取25.0 mg聚乙二醇400溶于30 mL雙蒸水構(gòu)成水相。將有機相在1 000 r/min攪拌下緩慢注入水相，溫度維持在(72±2)℃，攪拌條件下蒸發(fā)除去有機溶劑并濃縮至(20±3)mL，得到黃色半透明乳液。將所得乳液置于冰水混合物中，1 000 r/min攪拌下冷凍固化2 h，得到黃芩苷-SLN分散液。不添加黃芩苷，按照上述制備方法得到空白SLN分散液。

2.2 黃芩苷-SLN分散液的評價 透射電子顯微鏡觀察黃芩苷-SLN分散液中納米粒的形態(tài)[8]，馬爾文粒度儀考察黃芩苷-SLN分散液中納米粒的粒徑、多分散指數(shù)(polydispersity index，PDI)和Zeta電位。

2.3 體外釋藥考察

2.3.1 紫外分光光度法線性試驗及其方法學考察 精密稱取黃芩苷對照品10.8 mg，無水乙醇溶解并定容于10 mL容量瓶中作為儲備液，分別精密吸取10、30、50、70、90、100 μL于10 mL容量瓶中，加透析介質(zhì)稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度(ρ)分別為1.08、3.24、5.40、7.56、9.72、10.8 μg/mL系列對照品溶液，280 nm波長測定吸光度(A)值，計算得到回歸方程。配制3.24、5.40、10.8 μg/mL 3種濃度黃芩苷對照品溶液，1 d內(nèi)測定5次，考察日內(nèi)精密度；5 d中每日測定1次，考察日間精密度。精密吸取空白SLN分散液1 mL，加入黃芩苷及乙醇配制成3.24、5.40、10.8 μg/mL 3種濃度的對照品溶液，在280 nm處測定A值，將所得數(shù)據(jù)代入標準曲線方程計算，得到回收率。配制3.24、5.40、10.8 μg/mL 3種濃度黃芩苷對照品溶液，分別于0、2、4、6、8 h測定，考察重復(fù)性。配制3.24、5.40、10.8 μg/mL 3種濃度黃芩苷對照品溶液，室溫避光放置24 h后測定，考察穩(wěn)定性。

2.3.2 體外釋藥方法 采用透析袋法測定黃芩苷-SLN分散液在含0.2% Tween80的PBS溶液(pH=7.4)中的釋放行為，釋放容積為100 mL。取黃芩苷-SLN分散液10 mL(相當于黃芩苷A質(zhì)量2.5 mg)置于透析袋內(nèi)，轉(zhuǎn)速為100 r/min，溫度為(37.0±0.5)℃，在預(yù)定時間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0、36.0 h取樣5.0 mL，同時補充同容積釋放介質(zhì)。通過紫外分光光度儀測定樣品中藥物濃度，計算累計釋放度。

2.4 黃芩苷-SLN凍干粉的制備 取20 mL黃芩苷-SLN分散液置于塑料表面皿中，加入0.6 g D-甘露糖，保鮮膜包封塑料表面皿，于-80 ℃預(yù)凍24 h。迅速轉(zhuǎn)移至-50 ℃凍干機擱板上進行凍干，冷凍干燥24 h，得到黃芩苷-SLN凍干粉。

2.5 黃芩苷-SLN凍干粉的評價 按文獻[8]的方法在透射電子顯微鏡下觀察黃芩苷-SLN凍干粉中納米粒的形態(tài)，考察其粒徑、PDI和Zeta電位。按“2.1”項下方法制備空白SLN分散液，再按“2.4”項下方法制備空白-SLN凍干粉，按處方比例混合黃芩苷及空白-SLN凍干粉研磨后得到物理混合物。分別取適量黃芩苷、物理混合物、空白-SLN凍干粉和黃芩苷-SLN凍干粉，按照文獻[8]的方法利用差式掃描量熱儀、傅里葉紅外光譜對上述樣品進行掃描，分析藥物在黃芩苷-SLN凍干粉中的存在狀態(tài)。

2.6 黃芩苷體內(nèi)測定方法的建立

2.6.1 溶液的配制 精密稱取黃芩苷對照品5.08 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，甲醇定容得濃度為50.8 μg/mL的黃芩苷對照品儲備液。精密稱取蘆丁5.43 mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇定容得濃度為54.3 μg/mL蘆丁母液。精密吸取蘆丁母液3.40 mL，置于25 mL棕色容量瓶中，甲醇定容得濃度為7.41 μg/mL的蘆丁內(nèi)標儲備液。上述溶液均放于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6.2 色譜條件 色譜柱：Welch C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相：甲醇-體積分數(shù)為0.1%磷酸水溶液(容積比47∶53)；檢測波長為280 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：32 ℃；進樣量：20 μL。

2.7 組織樣品的處理 精密稱量小鼠各器官組織，加3倍量的甲醇組織勻漿。精密量取1 mL組織勻漿液，于8 000 r/min下離心10 min，吸取上清液400 μL置于EP管中。分別加入7.41 μg/mL內(nèi)標物蘆丁200 μL，甲醇600 μL，乙腈800 μL及1 mol/L磷酸二氫鉀水溶液200 μL。將樣品渦旋超聲后，于10 000 r/min下離心10 min，移取上清液置于另一個EP管中，50 ℃水浴氮氣吹干，殘留物采用100 μL流動相溶解，渦旋，于20 000 r/min下離心10 min，吸取上清液，按“2.6.2”項下色譜條件進樣。

2.8 小鼠組織分布實驗 健康昆明種小鼠108只，隨機分為2組，每組54只。按照9.5 mg/mL黃芩苷質(zhì)量濃度配置黃芩苷-SLN凍干粉混懸液(黃芩苷-SLN凍干粉用雙蒸水復(fù)溶，臨用時現(xiàn)場配制)和黃芩苷混懸液(將黃芩苷原料藥分散在雙蒸水中，臨用時現(xiàn)場配制)。一組小鼠灌胃黃芩苷-SLN凍干粉混懸液(劑量為144 mg/kg)，另一組小鼠灌胃黃芩苷混懸液(劑量為144 mg/kg)，給藥后分別于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h脫頸處死小鼠，取心、肝、脾、肺、腎、腦，清洗組織表面血液，濾紙吸干，精密稱量后放入EP管中備用，再按照“2.7”項下方法處理。

按照文獻[9]的方法，以靶向效率(targeting efficiency，Te)、相對靶向效率(relative targeting efficiency，Rte)和靶向指數(shù)(targeting index，TI)為評價指標，考察黃芩苷-SLN凍干粉混懸液相對于黃芩苷混懸液的靶向性。采用DAS 2.0軟件擬合得到相關(guān)藥物代謝動力學參數(shù)，計算公式如下：

R(Te)=A(AUCi靶向)/∑A(AUCi)

R(TI)=A(AUCi靶向)/A(AUCi參比)

R(Rte)=[R(Te靶向)-R(Te參比)]/R(Te參比)

式中AUCi為濃度-時間曲線的第i個組織的藥時曲線下面積(area under curve, AUC)，∑AUCi參比是包括靶組織在內(nèi)的所有組織的AUC之和。AUCi參比為參比制劑的AUCi，Te參比為參比制劑的Te。

3 結(jié)果

3.1 黃芩苷-SLN分散液中納米粒的外觀形態(tài)、粒徑及Zeta電位 黃芩苷-SLN分散液中納米粒呈圓形或橢圓形，大小均一，見圖1。粒徑為(207±5.9)nm，分散系數(shù)為0.134±0.011，見圖2A。Zeta電位為(-35.4±7.5)mV，見圖2B。

圖1 透射電子顯微鏡下黃芩苷-SLN分散液的形態(tài)(×20 000倍)

圖2 黃芩苷-SLN分散液粒徑分布圖(A)和電位圖(B)

3.2 黃芩苷-SLN分散液的釋放度

3.2.1 方法學考察 黃芩苷在溶出介質(zhì)中最大吸收波長為280 nm，標準曲線為A=0.081 7ρ-0.035 5(r=0.999 0)，線性范圍是1.08～10.8 μg/mL。結(jié)果顯示，日間、日內(nèi)精密度RSD均小于2%，回收率為99.21%～99.76%，重復(fù)性和穩(wěn)定性的RSD均小于2%，該方法可用來考察黃芩苷-SLN分散液的釋放度。

3.2.2 黃芩苷-SLN分散液釋放度方程的擬合 以累積釋放度Q對時間t作圖，得到累積釋藥曲線，見圖3。通過零級動力學、一級動力學、Higuchi、Ritger-Peppas方程擬合，黃芩苷-SLN分散液中黃芩苷-SLN體外釋放最符合Ritger-Peppas方程(r=0.955 6)。見表1。

圖3 黃芩苷-SLN分散液體外釋放曲線(n=3)

3.3 黃芩苷-SLN凍干粉中納米粒的外觀形態(tài)、粒徑和Zeta電位 黃芩苷-SLN凍干粉中納米粒呈圓形或橢圓形，見圖4。黃芩苷-SLN凍干粉粒徑為(398.5±2.08)nm，PDI為0.562±0.023，見圖5A；Zeta電位為(-16.4±6.96)mV，見圖5B。

表1 黃芩苷-SLN分散液體外釋放曲線方程擬合

圖4 透射電子顯微鏡下黃芩苷-SLN凍干粉的形態(tài)(×20 000倍)

3.3.1 采用差式掃描量熱儀進行樣品熱分析 取適量黃芩苷、物理混合物、黃芩苷-SLN凍干粉及空白-SLN凍干粉，以空鋁坩堝為參比物，在另一鋁坩堝放入約5 mg的樣品，升溫速率為20 ℃/min，掃描范圍為50～250 ℃，差式掃描量熱儀分析結(jié)果見圖6。黃芩苷在220 ℃出現(xiàn)單一吸收峰，此吸收峰為黃芩苷結(jié)晶吸熱峰；空白-SLN凍干粉在140 ℃左右出現(xiàn)單一吸收峰，該吸收峰與凍干保護劑D-甘露糖的熔點峰相近，應(yīng)為D-甘露糖的吸熱峰；物理混合物中兩者特征峰并未發(fā)生明顯變化，表明藥物晶型未發(fā)生改變，仍以結(jié)晶形式存在；黃芩苷-SLN凍干粉未見黃芩苷特征吸熱峰，除D-甘露糖吸熱峰外無其他顯著吸熱峰，表明黃芩苷存在形態(tài)變化，以無定形狀態(tài)存在于黃芩苷-SLN凍干粉中。

圖5 黃芩苷-SLN凍干粉粒徑分布圖(A)和電位圖(B)

注：a.黃芩苷；b.物理混合物；c.空白-SLN凍干粉；d.黃芩苷-SLN凍干粉

圖6 樣品的差式掃描量熱分析圖譜

3.3.2 采用傅里葉紅外光譜進行結(jié)構(gòu)分析 取適量黃芩苷、物理混合物及黃芩苷-SLN凍干粉與KBr混合壓片，于400～4000 cm-1的紅外光下掃描，見圖7。結(jié)果顯示黃芩苷在3 300、1 000 cm-1處分別出現(xiàn)了羥基、羰基特征吸收峰，在1 600 cm-1處出現(xiàn)苯環(huán)骨架伸縮振動特征吸收峰(見圖7a)。黃芩苷在物理混合物(3 300、1 600、1 000 cm-1，見圖7b)和黃芩苷-SLN凍干粉(3 300、1 600、1 000cm-1，見圖7c)中的特征吸收峰基本一致，未出現(xiàn)新特征吸收峰，表明在黃芩苷-SLN凍干粉制備過程中藥物的化學性質(zhì)未變化。

注：a.黃芩苷；b.物理混合物；c.空白-SLN凍干粉；d.黃芩苷-SLN凍干粉

圖7 樣品的傅里葉紅外光譜分析圖譜

3.4 方法學考察

3.4.1 專屬性考察 以肝組織為例，黃芩苷和蘆丁的保留時間分別為14.41 min和7.59 min，見圖8。兩者分離度良好，組織中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾黃芩苷和蘆丁的測定，該方法專屬性良好。

注：A.肝組織勻漿液；B.加藥肝組織勻漿液+蘆丁內(nèi)標；C.空白肝組織勻漿液；1.蘆??；2.黃芩苷

圖8 小鼠肝組織樣品專屬性考察

3.4.2 線性回歸方程和線性范圍考察 精密移取空白組織勻漿液400 μL置于10 mL EP管中，加入黃芩苷對照品溶液，得到一系列不同質(zhì)量濃度(0.068 58、0.114 3、0.190 5、0.317 5、0.630 0、1.270 0、2.540 0、5.080 0、10.160 0 μg/mL)的黃芩苷對照品溶液，按照“2.7”項下方法處理組織樣品，按照“2.6.2”項下色譜條件測定血漿和組織樣品中黃芩苷和蘆丁的峰面積，以黃芩苷與蘆丁的峰面積比值(R)對質(zhì)量濃度(ρ)進行線性回歸，得到各組織樣品的回歸方程。結(jié)果見表2。

3.4.3 精密度和回收率試驗 取各空白組織勻漿液400 μL配制黃芩苷低濃度(0.068 58 μg/mL)、中濃度(2.54 μg/mL)、高濃度(10.16 μg/mL)組織樣品，按照“2.7”項下方法處理組織樣品后進樣分析。日內(nèi)精密度各濃度樣品測定5次，日間精密度每天進樣1次，連續(xù)5 d，計算絕對回收率及相對回收率。結(jié)果顯示，3種濃度的日內(nèi)精密度和日間精密度均小于8.7%，3種濃度的絕對回收率為85.45%～94.88%，相對回收率為98.28%～101.94%，滿足測試方法學要求。

表2 黃芩苷在小鼠各組織樣品中的回歸方程

3.4.4 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗 取各空白組織勻漿液400 μL，配制黃芩苷低濃度(0.068 58 μg/mL)、中濃度(2.54 μg/mL)、高濃度(10.16 μg/mL)組織樣品各1份，分別于0、2、4、6、8 h，按照“2.7”項下方法處理組織樣品后進樣分析。取各空白組織勻漿液400 μL，配制黃芩苷低濃度(0.068 58 μg/mL)、中濃度(2.54 μg/mL)、高濃度(10.16 μg/mL)組織樣品各5份，分別于室溫放置24 h，-20 ℃反復(fù)凍融2次，按照“2.7”項下方法處理組織樣品后進樣分析。結(jié)果顯示，3種濃度的重復(fù)性RSD均小于9.1%，3種濃度的室溫穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性的RSD均小于9.4%，滿足測試方法學要求。

3.5 小鼠體內(nèi)組織分布研究 與黃芩苷混懸液組小鼠各組織AUC0-t相比，黃芩苷-SLN凍干粉混懸液組小鼠各組織的AUC0-t均增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。結(jié)果表明口服黃芩苷-SLN凍干粉混懸液可能通過提高黃芩苷生物利用度[6]，提高藥物在小鼠各組織器官中分布。

由Te的結(jié)果可見，黃芩苷-SLN凍干粉混懸劑組小鼠體內(nèi)的分布趨勢為：R(Te肝)>R(Te脾)>R(Te腦)>R(Te腎)>R(Te肺)>R(Te心)；黃芩苷混懸劑組小鼠體內(nèi)分布趨勢為：R(Te肝)>R(Te腦)>R(Te腎)>R(Te肺)>R(Te脾)>R(Te心)。結(jié)果表明，黃芩苷混懸液主要分布在小鼠體內(nèi)肝、腦、腎組織中，而黃芩苷-SLN凍干粉混懸液主要分布在小鼠肝、脾、腦組織中。黃芩苷被包載于SLN后，藥物在小鼠體內(nèi)分布明顯變化。

黃芩苷-SLN凍干粉混懸液組小鼠心、脾的Rte分別為40.47%、79.67%，均為正值，其余組織的Rte均為負值；黃芩苷-SLN凍干粉混懸液組小鼠各組織的TI均大于1，各組織的TI大小順序為：R(TI脾)>R(TI心)>R(TI肝)>R(TI腦)>R(TI腎)>R(TI肺)，黃芩苷-SLN凍干粉提高了藥物在小鼠體內(nèi)各個臟器內(nèi)的分布，對脾臟、心臟的靶向性較好。

表3 小鼠體內(nèi)組織藥物分布結(jié)果(n=6)

注：與黃芩苷混懸液比較，*P<0.05

4 討論

本實驗制備黃芩苷-SLN分散液，為提高SLN表面膜的穩(wěn)定性[10]，降低藥物和SLN的水解和氧化速度，加入凍干保護劑，利用冷凍干燥技術(shù)制備黃芩苷-SLN凍干粉。黃芩苷-SLN由于在冷凍干燥過程中，隨著水分散失，粒徑間出現(xiàn)聚集粘結(jié)導(dǎo)致粒徑增大[11]。SLN分散液制備成SLN凍干粉，有助于SLN獲得長期的物理和化學穩(wěn)定性[12]，對保持實驗中藥物的一致性具有積極意義。

小鼠灌胃黃芩苷-SLN凍干粉混懸液后，肝組織靶向指數(shù)為41.19。黃芩苷-SLN凍干粉可提高藥物吸收，較好地靶向分布于肝組織，更好地治療肝臟疾病。此外，黃芩苷-SLN選擇性地靶向分布小鼠脾組織，可能與實驗利用膽固醇作為載脂材料有關(guān)。外源性攝入的膽固醇可在小腸腔內(nèi)與磷脂、膽酸鹽結(jié)合形成微粒，并與長鏈脂肪酸結(jié)合形成膽固醇酯[13-14]。膽固醇酯促進乳糜微粒的形成，乳糜微粒易由腸道淋巴系統(tǒng)攝取[15-16]，因此可提高藥物在淋巴組織中的濃度。實驗制備的黃芩苷-SLN在小鼠肝組織中分布量最大，對脾組織的靶向性較強，表現(xiàn)出良好的肝靶向及促進藥物經(jīng)淋巴轉(zhuǎn)運的潛力，對其臨床應(yīng)用具有積極的意義。