楊心萍，宋詞，張偉豪，劉艷,2，王洲,2，薛正蓮,2*

1(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖，241000) 2(微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 蕪湖，241000)

腺苷是一種遍布人體細(xì)胞的重要內(nèi)源性核苷酸，可直接進(jìn)入心肌經(jīng)磷酸化生成腺苷酸，參與心肌能量代謝[1-2]。因其在心血管系統(tǒng)中有很重要的生化代謝和調(diào)節(jié)功能而被人們熟知[3]。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷具有生產(chǎn)成本低、反應(yīng)條件溫和、原材料廣泛等優(yōu)點。目前腺苷菌株主要通過誘變選育方式得到，高效的誘變技術(shù)及篩選方法無疑可大大提高獲得高產(chǎn)菌株的效率。

由清華大學(xué)自主研發(fā)的新型常壓室溫等離子體(atmospheric room temperature plasma, ARTP)微生物快速突變技術(shù)具有安全性高、操作簡單、突變率高等優(yōu)勢[4-7]。ARTP可以快速地突變細(xì)菌、真菌等多種微生物，是可以快速高效地獲得高產(chǎn)菌株的新型誘變劑[8-10]。大量的研究表明，ARTP誘變與其他誘變相結(jié)合的方式可以提高突變率[9,11-13]。本文選用化學(xué)誘變劑5-BU，其作用機理是作為堿基類似物，與正常堿基結(jié)構(gòu)相似，在DNA復(fù)制過程中，取代正常堿基滲入DNA分子[14]。目前關(guān)于ARTP與5-BU結(jié)合的誘變方式還鮮有報道。

孔板發(fā)酵實現(xiàn)快速選育在發(fā)酵行業(yè)中有很多成功的應(yīng)用[15-17]。與傳統(tǒng)的搖瓶發(fā)酵方式相比，孔板具有發(fā)酵體積小、篩選效率高等優(yōu)勢。邊緣孔現(xiàn)象在酶聯(lián)免疫反應(yīng)中較為常見，表現(xiàn)為邊緣孔顯色較中間孔顏色更深[18-19]。在孔板培養(yǎng)好氧微生物的過程中出現(xiàn)的邊緣孔效應(yīng)，還未見報道。本研究使用48孔板對枯草芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵，對孔板均一性進(jìn)行考察，以提高菌株篩選的準(zhǔn)確性。

本研究運用ARTP與5-BU相結(jié)合的方式，對48孔板均一性進(jìn)行考察，使用SG抗性平板以及48孔板發(fā)酵的方式，篩選得到遺傳穩(wěn)定的腺苷突變菌株。以期該復(fù)合誘變方法能選育腺苷高產(chǎn)菌株，也為其他產(chǎn)核苷類物質(zhì)菌株的選育提供了參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

枯草芽孢桿菌(B-0),本實驗室保藏。

1.2 儀器及試劑

UV-5500PC紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；ARTP-IIS ARTP育種機，北京思清源生物科技有限公司?；瘜W(xué)藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨10，酵母膏10，牛肉膏10，尿素5，NaCl 2.5，瓊脂20，115 ℃滅菌30 min，pH 7。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨10，酵母膏10，牛肉膏3，尿素5，KCl 2，泡敵0.3，115 ℃滅菌30 min，pH 7。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖106.25，玉米漿30，多糖茸精6，KH2PO41，MgSO4·7H2O 2.5，尿素3，KCl 2，(NH4)2SO43，MnSO4·H2O 0.05，檸檬酸4.5，味精4，泡敵0.3，115 ℃滅菌30 min，pH 7。

抗性培養(yǎng)基：在固體培養(yǎng)基上添加0.8～1.2 g/L SG制成抗性培養(yǎng)基，SG過濾除菌。

1.4 腺苷含量的測定

取適量發(fā)酵液于2 mL離心管中，煮沸5 min，8 000 r/min離心5 min后，使用濃度為 0.1 mol/L HCl溶液，采用10倍梯度稀釋法，稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛?，?60 nm處測定吸光度。

1.5 發(fā)酵培養(yǎng)條件

孔板發(fā)酵中，使用已滅菌的鑷子夾取已滅菌的牙簽挑取單菌落，接入發(fā)酵液中；搖瓶發(fā)酵中，采用體積分?jǐn)?shù)8%的種子液接入發(fā)酵液中。培養(yǎng)條件均為37 ℃，240 r/min，培養(yǎng)3 d。

1.6 抗性濃度的選擇

選取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7和0.8 g/L的SG分別制備平板，每個質(zhì)量濃度制備3個平板。取稀釋后的100 μL對數(shù)期菌液涂布于各個平板上，37 ℃培養(yǎng)3 d后觀察生長情況。

1.7 ARTP誘變處理

取1 mL對數(shù)期的菌懸液，離心去上清后使用生理鹽水垂懸，稀釋至106～108CFU/mL，完成菌懸液的制備。將小鐵片灼燒后放至室溫，均勻平鋪10 μL菌懸液。在ARTP機器放電功率為120 W，照射距離2 mm，氣流量為10 SLM的條件下，對小鐵片上的菌懸液分別進(jìn)行0、15、30、45、60、75和90 s的誘變處理，誘變結(jié)束后充分振蕩洗脫，適當(dāng)稀釋后，分別涂布于普通平板和抗性平板，每組3個平行，培養(yǎng)2～3 d后觀察生長情況。

1.8 5-BU誘變處理

取1 mL對數(shù)期的菌懸液，離心去上清后使用生理鹽水垂懸，37 ℃振蕩饑餓培養(yǎng)8 h，使其盡量消耗自身的營養(yǎng)物質(zhì)。稱取0.02 g 5-BU，加入10 mL去離子水，50 ℃低溫?zé)崛躘20]。將5-BU 加入完全固體培養(yǎng)基內(nèi)，使其最終質(zhì)量濃度為10、20、30、40、50和60 μg/mL。將饑餓培養(yǎng)8 h的菌懸液適當(dāng)稀釋后，分別涂布于含有0.88 g/L SG和不含有SG的5-BU平板上，使其在生長的過程中被誘變，每組3個平行，培養(yǎng)2～3 d后觀察生長情況。

1.9 ARTP與5-BU復(fù)合誘變處理

將5-BU溶液與SG溶液分別加入固體培養(yǎng)基中，加入后的最終質(zhì)量濃度分別為20 μg/mL與0.88 g/L。將ARTP誘變處理60 s后的菌懸液，適當(dāng)稀釋后，涂布于普通平板和含有5-BU及SG的平板，培養(yǎng)2～3 d后觀察生長情況。

1.10 致死率、正突變率計算

經(jīng)過1.6、1.7、1.8節(jié)中的方法處理后，根據(jù)菌株在不同平板上的生長情況，按照公式(1)、(2)分別計算不同處理時間下枯草芽孢桿菌的致死率與正突變率。

(1)

(2)

式中：U，未經(jīng)處理的對照組平板上生長的菌落數(shù)；S，各處理劑量下平板上生長的菌落數(shù)；P，在含有0.88 g/L SG的抗性平板上生長的菌落數(shù)。

1.11 突變菌株遺傳穩(wěn)定性檢測

將篩選得到的突變菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)10代，分別檢測每代菌株發(fā)酵液中腺苷產(chǎn)量，以確定突變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.12 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2018繪圖，IBM SPSS Statistics 25 數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 孔板均一性考察

2.1.1 48孔板邊緣孔效應(yīng)驗證

在應(yīng)用48孔板進(jìn)行誘變菌株復(fù)篩時，發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)菌株集中于48孔板邊緣位置。將此類“高產(chǎn)菌株”進(jìn)行搖瓶發(fā)酵后，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)量并未有明顯提升。這意味著孔板發(fā)酵過程中可能存在邊緣效應(yīng)。如圖1所示，選擇24孔板中3個位置，即1號長邊緣孔、2號短邊緣孔，3號中間孔。選擇同一株菌進(jìn)行發(fā)酵后，比較孔板中3個位置的腺苷含量，進(jìn)行3組平行實驗，結(jié)果如表1所示。

圖1 48孔板位置示意圖Fig.1 48-well plate location diagram

表1 48孔板不同位置腺苷產(chǎn)量Table 1 48-well plate adenosine yield at different positions

注：同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母代表不同類型孔間存在顯著性差異(P<0.05)

3個位置孔中腺苷產(chǎn)量表現(xiàn)出明顯差異。對比發(fā)酵72 h不同孔間發(fā)酵液剩余量，發(fā)現(xiàn)邊緣孔剩余發(fā)酵液體積明顯低于中間孔體積。說明邊緣效應(yīng)的出現(xiàn)可能與孔間水分蒸發(fā)不均有關(guān)。

2.1.2 孔板邊緣效應(yīng)的消除

實驗結(jié)果表明采取空置邊緣孔及使用封口膜緊密纏繞孔板蓋與孔板的接口處，這2種方法均不能消除孔板邊緣效應(yīng)，而將孔板邊緣孔位置填充2 mL的無菌水或發(fā)酵液，可有效消除邊緣孔效應(yīng)。選擇同一株菌進(jìn)行48孔板發(fā)酵后，對其產(chǎn)量進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示，t值為0.003，小于顯著性水平α=0.05條件下的臨界值，故中間24孔孔間差異不顯著，可以排除在復(fù)篩過程中孔板間的系統(tǒng)誤差。

表2 48孔板孔間差的t-Test結(jié)果Table 2 t-Test result of difference between wellsin a 48-well plate

2.2 不同接種方式對腺苷產(chǎn)量的影響

采用單菌落接種發(fā)酵液的方式，可以減少種子培養(yǎng)過程，縮短篩選周期。將同一株菌，采用平板與種子液2種方式活化，將活化后的菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵結(jié)束后分別測定產(chǎn)量。如表3所示，t值為0.518，小于顯著性水平α=0.05條件下的臨界值，表明采用平板菌落及種子液2種接種方式差異不顯著。故在48孔板發(fā)酵中，采用單菌落直接接種以提高篩選效率。

表3 單菌落與種子液2種接種方式的t-Test結(jié)果Table 3 t-Test results of single colony and seed liquidinoculation methods

2.3 48孔板發(fā)酵與搖瓶發(fā)酵腺苷產(chǎn)量之間的相關(guān)性

隨機選擇誘變過程中得到的30株突變株，分別采用250 mL擋板搖瓶與48孔板發(fā)酵的方式，將得到的腺苷產(chǎn)量進(jìn)行線性擬合后，y=1.014 9x-3.704 8,R2=0.921 3(圖2)，表示2種發(fā)酵方式下的腺苷產(chǎn)量具有良好的線性關(guān)系，可以使用48孔板代替搖瓶發(fā)酵，提高篩選效率。

圖2 48孔板與250 mL搖瓶發(fā)酵腺苷產(chǎn)量的相關(guān)性Fig.2 Correlation between 48-well plate and 250 mL baffled shake flask fermentation yield

2.4 SG抗性濃度的選擇

SG作為腺苷的結(jié)構(gòu)類似物，初篩過程中可以篩選掉大部分負(fù)突變菌株，提高篩選效率。按照1.6中的方法對SG臨界濃度進(jìn)行確定，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)SG質(zhì)量濃度為0.7 g/L時，平板菌株呈現(xiàn)微弱生長，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.8 g/L時，平板上未見生長菌落。因此，0.8 g/L SG為菌株的臨界耐受濃度。將抗性濃度提升10%作為誘變初篩濃度，即SG抗性質(zhì)量濃度為0.88 g/L。

a～i，SG質(zhì)量濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7和0.8 g/L圖3 不同SG質(zhì)量濃度平板篩選突變株Fig.3 Screening mutants with different SG concentrations

2.5 ARTP誘變最佳劑量確定

按照1.7中的方法進(jìn)行誘變處理后，如圖4所示，ARTP對枯草芽孢桿菌有較強的致死能力，當(dāng)照射60 s時，致死率達(dá)到88.24%，正突變率為36.36%，因此，后續(xù)復(fù)合誘變處理時間選定60 s。

圖4 ARTP誘變時間與枯草芽孢桿菌的致死率和正突變率的關(guān)系Fig.4 Relationship between ARTP mutagenesis time and lethal and positive mutation rates

2.6 5-BU誘變最佳劑量確定

5-BU作為堿基誘變劑[14,21]，均勻混入培養(yǎng)基中，使菌株在生長的過程發(fā)生突變。按照1.8中的方法進(jìn)行誘變處理后，當(dāng)質(zhì)量濃度為20 μg/mL，致死率與正突變率達(dá)到最高，分別為88.24%與18.18%，故20 μg/mL為最佳誘變劑量。

圖5 5-BU誘變濃度與枯草芽孢桿菌的致死率和正突變率的關(guān)系Fig.5 Relationship between 5-BU mutagenesis time and lethal and positive mutation rates

2.7 ARTP與5-BU復(fù)合誘變

如圖6所示，5-BU與ARTP單獨誘變時，誘變正突變率分別為18.18%和36.36%，復(fù)合誘變后，正突變率提升至50%。使用1.9中的方法進(jìn)行復(fù)合誘變，對菌株進(jìn)行6輪誘變處理后，結(jié)果如圖7所示，在第6輪誘變中，篩選到1株高產(chǎn)菌株，產(chǎn)量為11.99 g/L，較出發(fā)菌株提升34.67%。SG抗性濃度達(dá)1.1 g/L，較初始SG濃度提升37.5%。將得到的腺苷高產(chǎn)菌株命名為B-6。

圖6 三種誘變方式的正突變率比較Fig.6 Comparison of positive mutation rates among three mutagenesis methods

圖7 六輪ARTP誘變復(fù)篩結(jié)果Fig.7 Results of 6 rounds of ARTP mutagenesis rescreening

2.8 高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性考察

對突變株B-6進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性實驗，結(jié)果如圖8所示，經(jīng)過10代連續(xù)劃線培養(yǎng)并發(fā)酵，對發(fā)酵液中腺苷產(chǎn)量進(jìn)行測定，腺苷含量為11.85 g/L左右。結(jié)果表明突變株B-6具有較好的穩(wěn)定性，能高效生產(chǎn)腺苷。

圖8 突變株B-6產(chǎn)腺苷的遺傳穩(wěn)定性Fig.8 Genetic stability of adenosine-producing mutant B-6

3 結(jié)果與討論

建立高效、準(zhǔn)確的選育方法是菌株誘變選育的關(guān)鍵。廖丹等[22]在熒光素酶報告基因?qū)嶒炛?，發(fā)現(xiàn)使用48孔板時存在邊緣孔效應(yīng)，且用磷酸鹽緩沖液填充可以削弱邊緣效應(yīng)。本研究通過對48孔板邊緣孔效應(yīng)的考察，發(fā)現(xiàn)用48孔板培養(yǎng)枯草芽孢桿菌B-0時也存在邊緣孔效應(yīng)，通過2 mL無菌水填充可以有效地消除邊緣孔效應(yīng)。

ARTP誘變作為一種新型高效的誘變劑[4]，與5-BU結(jié)合表現(xiàn)出良好的誘變效果。本研究中，采用ARTP與5-BU復(fù)合誘變的方式，并結(jié)合SG的抗性篩選，正突變率可達(dá)到50%，經(jīng)過6輪誘變后，最終得到1株腺苷高產(chǎn)菌株B-6，48孔板中產(chǎn)量為11.94 g/L，較出發(fā)菌株B-0(產(chǎn)量為7.8 g/L)提升34.67%，經(jīng)10代傳代培養(yǎng)后，腺苷產(chǎn)量穩(wěn)定，可以用于后續(xù)的進(jìn)一步研究。