仇薪鑫，牛華鋒，賈燕青，張振倉

(楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院 動(dòng)物工程分院，陜西 楊凌 712100)

泰勒焦蟲病史嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的寄生蟲病，其病原較多，主要包括環(huán)形泰勒蟲(T. annulata)和瑟氏泰勒蟲(T. sergenti)[1]。獸醫(yī)臨床常用血涂片進(jìn)行染色鏡檢，雖然該方法簡(jiǎn)便易行，但是十分依賴鑒定工作者的臨床經(jīng)驗(yàn)，而且可能產(chǎn)生鑒定錯(cuò)誤，檢出率較低，影響治療。為了對(duì)羊泰勒蟲病的病原進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定，筆者研究在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，結(jié)合分子生物學(xué)方法，根據(jù)T. annulata 30 KDa基因和T. sergent MPSP表面蛋白基因序列分別設(shè)計(jì)各自的上下游引物，進(jìn)行擴(kuò)增和序列分析。筆者研究對(duì)環(huán)形泰勒蟲和色泰勒蟲具有較高的敏感性和特異性，實(shí)際診斷中還能夠?qū)Σ煌牟≡龀隹焖勹b定，為準(zhǔn)確的針對(duì)性治療提供參考。

1 試驗(yàn)材料

1.1 研究對(duì)象

發(fā)生泰勒焦蟲病的絨山羊血液樣品，環(huán)形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲陽性標(biāo)準(zhǔn)品(由甘肅省農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院贈(zèng)送)。

1.2 試劑材料

試劑：DNA提取試劑盒，GenStar公司產(chǎn)品，姬姆薩染色液，10xBuffer緩沖液，四種dNTP底物，4 mmol·L-1MgCl2，Tag DNA聚合酶，雙蒸水，溴化乙錠，瓊脂糖等，引物由上海生工合成。

2 試驗(yàn)方法

2.1 血液涂片的制作和染色

絨山羊頸靜脈采血，加入枸櫞酸鈉抗凝，-20℃保存?zhèn)溆?。取一滴抗凝血于載玻片，另一個(gè)載玻片從側(cè)面推片制備血圖片，自然干燥，甲醇固定5 min，然后經(jīng)吉姆薩染色，水洗，鏡檢。

2.2 羊泰勒蟲PCR檢測(cè)方法的建立

2.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank登錄的環(huán)形泰勒蟲30 kDa和瑟氏泰勒蟲MPSP表面蛋白序列為模板設(shè)計(jì)引物，送上海生工合成。引物序列如下：環(huán)形泰勒蟲(T. Annulata) 30 KDa 上游引物 5’-GTAACCTTTAAAAACGT-3’;下游引物 5’-GTTACGAACATGGGTTT-3’，瑟氏泰勒蟲(T. sergenti)MPSP 上游引物5’-CACAGCTATGTTGTCCAAGAG-3’；下游引物 5’-TGTGAGACTCAATGCGCCTA-3’預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為200 bp和830 bp。

2.2.2 PCR反應(yīng)及鑒定 環(huán)形泰勒蟲30kDa基因和瑟氏泰勒蟲MPSP PCR擴(kuò)增體系(20 μL)：模板，1 μL；上下游引物(10 pmol·L-1)各1 μL，2×Genestar Mix，10 μL；ddH2O, 7Μl。預(yù)設(shè)擴(kuò)增參數(shù)為：94℃ 5 min；然后94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2.2.3 最適退火溫度的篩選 將環(huán)形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品按照10-6稀釋，取1μL為模板進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增，退火的梯度范圍為51～59℃，確定最佳退火溫度。

2.2.4 敏感性試驗(yàn) 將環(huán)形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品按照10-2稀釋，按照2.2.2 PCR方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定合適PCR反應(yīng)的敏感性。

2.2.5 引物特異性試驗(yàn) 利用設(shè)計(jì)的特異性引物分別以不同的DNA陽性樣品(環(huán)形泰勒蟲、瑟氏泰勒蟲、呂氏泰勒蟲)為模板進(jìn)行特異性試驗(yàn)分析。

2.3 序列比對(duì)分析

將PCR進(jìn)行優(yōu)化，以發(fā)生血液泰勒蟲病絨山羊的血液DNA為模板，獲取的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)分析。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 血涂片結(jié)果

在羊血液焦蟲病流行地區(qū)，采集臨床癥狀為貧血、黃疸的羊抗凝血樣本，并做血涂片。經(jīng)姬姆薩染色，鏡檢(鏡檢 1 000×)，可見羊紅細(xì)胞內(nèi)羊泰勒蟲輪廓和其原生質(zhì)呈淺藍(lán)色。

3.2 PCR擴(kuò)增體系的預(yù)擴(kuò)增

用設(shè)計(jì)的環(huán)形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲的特異性引物，在上述PCR擴(kuò)增體系和預(yù)設(shè)的反應(yīng)參數(shù)，對(duì)環(huán)形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲DNA標(biāo)準(zhǔn)模板1μL進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。結(jié)果試驗(yàn)設(shè)計(jì)的的特異性引物能擴(kuò)增出的片段大小分別為193 bp和875 bp。

M.Marker2000:1.環(huán)形泰勒蟲PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.陰性對(duì)照

M.Marker2000:1.瑟氏泰勒蟲PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.陰性對(duì)照

3.3 PCR反應(yīng)參數(shù)中退火溫度的確定

對(duì)環(huán)形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲標(biāo)準(zhǔn)品DNA進(jìn)行1×106稀釋，進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增。從圖4和圖5可以看出，隨著退火溫度的變化產(chǎn)物的量也在變化。

M.Marker2000:1.51℃;2.52℃;3.53℃;4.55℃;5.55℃;6.56℃;7.57℃;8.58℃;9.59℃;

M.Marker2000:1.51℃;2.52℃;3.53℃;4.55℃;5.55℃;6.56℃;7.57℃;8.58℃;9.59℃;

對(duì)于環(huán)形泰勒蟲，退火溫度在54.0～57.0℃之間時(shí)特異性擴(kuò)增帶的亮度高，在56℃時(shí)最高。對(duì)于瑟氏泰勒蟲，退火溫度在53.0～57.0℃之間時(shí)特異性擴(kuò)增帶的亮度高，在55℃時(shí)最高。

退火溫度太高或者太低都會(huì)影響擴(kuò)增產(chǎn)物的量。因此以56℃和55℃分別作為環(huán)形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲反應(yīng)參數(shù)中的最適退火溫度。

3.4 引物特異性試驗(yàn)

環(huán)形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲引物分別只能夠擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物。

M.Marker2000:1.環(huán)形泰勒蟲;2.瑟氏泰勒蟲 3呂氏形泰勒蟲

M.Marker2000:1.瑟氏泰勒蟲;2.環(huán)形泰勒蟲 3.呂氏形泰勒蟲

3.5 敏感性試驗(yàn)

經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定環(huán)形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲標(biāo)準(zhǔn)DNA含量分別為150 mg·L-1和170 mg·L-1。反應(yīng)體系中檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)模板DNA的最大稀釋倍數(shù)為1x109，則環(huán)形泰勒蟲標(biāo)準(zhǔn)模板最低檢測(cè)量為0.15 fg，瑟氏泰勒蟲標(biāo)準(zhǔn)模板最低檢測(cè)量為0.17 fg。

M.Marker2000:1.1x101稀釋;2.1x103稀釋;

2.1x105稀釋;2.4x107稀釋;5.1x109稀釋;6.1x1011稀釋

M.Marker2000:1.1x101稀釋;2.1x103稀釋;

2.1x105稀釋;2.4x107稀釋;5.1x109稀釋;6.1x1011稀釋

3.6 序列比對(duì)分析

分別以環(huán)形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲基因組DNA為模板，利用設(shè)計(jì)的各自特異性引物在最佳反應(yīng)條件下(環(huán)形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲的退火溫度分別為56℃和55℃)進(jìn)行PCR能夠得到的特異性片段長(zhǎng)度分別為193 bp和875 bp。將擴(kuò)增片段測(cè)序，序列分析表明與GenBank中的環(huán)形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲同源性為100%。

4 討論

筆者研究通過血液涂片染色方法和PCR檢測(cè)方法對(duì)采集的兩份疑似感染泰勒蟲病的羊血液樣品進(jìn)行檢測(cè)，得出以下結(jié)論。血涂片染色鏡檢可見羊紅細(xì)胞內(nèi)蟲體大小約為0.5～1.5μm，原生質(zhì)呈淺藍(lán)色，染色質(zhì)呈紅色，蟲體呈梨籽形、環(huán)形、橢圓形、短桿形、圓點(diǎn)形等多形態(tài)，初步鑒定為該蟲體為泰勒蟲。以環(huán)形泰勒蟲的30 KDa表面蛋白基因序列和瑟氏泰勒蟲MPSP表面蛋白基因序列分別建立各自特異性PCR檢驗(yàn)方法。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)成功擴(kuò)增出193 bp和875 bp目的片段。將擴(kuò)增片段測(cè)序，序列分析表明與GenBank中注冊(cè)的環(huán)形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲同源性為100%。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，建立的PCR檢測(cè)方法能夠檢測(cè)出環(huán)形和瑟氏的最低量分別為0.15 fg和0.17 fg。

環(huán)形泰勒蟲致病性較強(qiáng),而瑟氏泰勒蟲具有分布范圍較廣的特點(diǎn)。兩種泰勒蟲常在野外發(fā)生混合感染，由于形態(tài)非常相似，傳統(tǒng)顯微鏡檢測(cè)不能很好區(qū)分它們，筆者試驗(yàn)建立的絨山羊環(huán)形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲的診斷方法敏感性強(qiáng)、檢測(cè)效率高，可廣泛應(yīng)用于兩種泰勒蟲的檢測(cè)，并為絨山羊環(huán)形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲的研究奠定了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。