張愛菊,張小林

(甘肅醫(yī)學(xué)院,平?jīng)?44000)

抗壞血酸(AA)又稱為維生素C(Vc),結(jié)構(gòu)中的烯二醇使其具有還原性?？箟难岵荒茉谌梭w中合成,只能從外界獲取,獲取途徑有兩條,一是水果和蔬菜;二是藥劑?？箟难岬臏y定方法主要有滴定法[1-2]、光譜法[3-5]、電化學(xué)分析法[6-7]和色譜法[8-9]等。滴定法靈敏度低,且標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定,不適合低含量抗壞血酸的測定。熒光法[10-11]具有檢出限低,抗干擾能力強等特點。

羅丹明B(RB)具有熒光特性,其陽離子與I3－通過靜電引力形成離子締合物,可使其熒光消失,基于碘化鉀-羅丹明B體系熒光猝滅法測定氧化性物質(zhì)的研究已有報道[12-18],但尚未見碘化鉀-羅丹明B熒光反猝滅法用于還原性藥物測定的研究報道。研究發(fā)現(xiàn)[19-20],在弱酸性條件下將碘溶液和羅丹明B混合即可使羅丹明B發(fā)生熒光猝滅,但在碘化鉀-羅丹明B締合物形成前加入抗壞血酸,溶液重新發(fā)出熒光,其熒光強度與抗壞血酸的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。本工作基于氧化還原和締合反應(yīng)原理,在不需催化、加熱及長時間等待的情況下完成藥劑和果汁中抗壞血酸的快速測定,其過程不受樣品渾濁度和色度的影響,準(zhǔn)確度高且檢出限較低(5.6×10－9mol·L－1)。目前,類似方法尚無相關(guān)報道。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

930N型熒光光度計;FA 2004N型分析天平;pHS-3C型精密pH計。

羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:1.0×10－3mol·L－1,稱取0.119 8 g羅丹明B固體,加水溶解并稀釋至250.0 mL,混合均勻。

羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液:1.0×10－4mol·L－1,稱取10.00 mL羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于100 mL容量瓶中,用水定容,混合均勻。

抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:5.00×10－2mol·L－1,稱取0.880 0 g抗壞血酸,用水溶解并稀釋至100.0 mL,混合均勻。

抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:5.00×10－4mol·L－1,移取抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1.00 mL于100 mL容量瓶中,用水定容,混合均勻。

抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:分別移取抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn) 溶 液 0,0.50,1.00,2.00,3.00,4.00,5.00 mL 于6個不同的50 mL容量瓶中,用水定容,配制成0,5,10,20,30,40,50μmol·L－1的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

乙酸-乙酸鈉緩沖溶液:0.1 mol·L－1,pH 為4.7。

碘標(biāo)準(zhǔn)溶液[21]:1.0×10－3mol·L－1。

所用試劑均為分析純,試驗用水為二次蒸餾水。

1.2 試驗方法

移取一定體積的樣品稀釋液(含抗壞血酸約0～0.35 mg)于50 mL容量瓶中,加入1.0×10－3mol·L－1碘標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0 mL,混合搖勻,再依次加入羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液5.00 mL,乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH為4.7)5.0 mL,用水定容,混合搖勻后靜置10 min。以1.0×10－6mol·L－1羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液作為靈敏度調(diào)試液,按照儀器工作條件對其進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜

按照試驗方法對羅丹明B溶液、羅丹明B-I3－-抗壞血酸和羅丹明B-I3－溶液在455～655 nm內(nèi)進行掃描,并繪制不同體系的熒光光譜,見圖1。其中羅丹明B、I3－和抗壞血酸的濃度分別為1.0×10－5,4.0×10－5,2.0×10－5mol·L－1。

結(jié)果表明:當(dāng)激發(fā)波長為365 nm時,羅丹明B在580 nm處有最大熒光強度;向羅丹明B溶液中加入I3－溶液后,羅丹明B溶液的熒光猝滅,熒光發(fā)射波長未發(fā)生改變;在I3－-羅丹明B締合物形成之前加入一定量的抗壞血酸后,熒光得以重現(xiàn),且熒光強度與抗壞血酸加入量有關(guān)。

2.2 試驗條件的選擇

2.2.1 羅丹明B的濃度及其用量

圖1 熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra

羅丹明B的熒光特性與其濃度息息相關(guān)[22]。當(dāng)羅丹明B的濃度不小于1.5×10－5mol·L－1時,羅丹明B會形成二聚體或多聚體,激發(fā)波長和發(fā)射波長逐漸紅移,自熄滅作用增強,羅丹明B的濃度與其對應(yīng)的熒光強度之間的線性消失,為了保證樣品測定過程中有足夠?qū)挾鹊木€性范圍和更低的檢出限,試驗選擇1.0×10－4mol·L－1的羅丹明B溶液的用量為5.00 mL,此時反應(yīng)液中羅丹明B的濃度為1.0×10－5mol·L－1。

2.2.2 碘標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積

在不含抗壞血酸的情況下,試驗考察了碘標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積對羅丹明B熒光強度的影響,結(jié)果見圖2。

圖2 碘標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積對羅丹明B熒光強度的影響Fig.2 Effect of volume of iodine standard solution added on fluorescence intensity of rhodamine B

由圖2可知:隨著碘標(biāo)準(zhǔn)溶液體積的增加,羅丹明B的熒光強度逐漸降低;當(dāng)?shù)鈽?biāo)準(zhǔn)溶液體積為0～2.0 mL時,線性度較高;當(dāng)?shù)鈽?biāo)準(zhǔn)溶液體積增加至4.0 mL時,羅丹明B的熒光強度開始趨于穩(wěn)定;當(dāng)?shù)鈽?biāo)準(zhǔn)溶液體積增加至6.0 mL時,羅丹明B的熒光強度幾乎不再發(fā)生變化。為了得到較為準(zhǔn)確的測定結(jié)果,試驗選擇的碘標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為2.0 mL。

2.2.3 體系的酸度

羅丹明B的熒光強度體現(xiàn)在羧基上[22],抗壞血酸在酸性條件下相對穩(wěn)定。取抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液2.00 mL,固定其他條件,在溶液中加入不同體積的0.1 mol·L－1HCl和0.1 mol·L－1NaOH 溶液,按試驗方法考察了在不同酸度體系下羅丹明B的熒光強度,結(jié)果見圖3。

圖3 體系的酸度對羅丹明B熒光強度的影響Fig.3 Effect of acidity of the system on fluorescence intensity of rhodamine B

由圖3可知:隨著體系pH的增加,游離態(tài)羅丹明B的羧基開始電離,并且電離程度逐漸增大,吸電子能力逐漸減弱,熒光強度逐漸增大;當(dāng)體系pH為4.0～8.0時,羅丹明B的熒光強度趨于穩(wěn)定;當(dāng)體系的pH大于9.0時,締合物中的碘發(fā)生歧化,羅丹明B的熒光強度繼續(xù)增大。這說明pH為4.0～8.0時,有利于羅丹明B和I3－發(fā)生締合,也有利于抗壞血酸氧化,試驗選擇了pH為4.7的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液作為反應(yīng)介質(zhì)。

2.2.4 反應(yīng)溫度與反應(yīng)時間

移取抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)液2.00 mL進行試驗,試驗考察了反應(yīng)溫度與反應(yīng)時間對羅丹明B熒光強度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):當(dāng)反應(yīng)溫度為20～35℃時,羅丹明B的熒光強度較大且變化幅度較小。試驗選擇的反應(yīng)溫度為常溫(25℃)。

抗壞血酸與I3－反應(yīng)速率較快,加入羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液后黃色瞬間變淺以至消失。在室溫下,羅丹明B與I3－在8 min內(nèi)反應(yīng)完全,且其熒光強度在40 min內(nèi)保持穩(wěn)定。試驗選擇加入羅丹明B靜置10 min后測定體系的熒光強度。

2.2.5 試劑的加入順序

試驗考察了抗壞血酸、碘和羅丹明B等3種試劑的加入順序?qū)w系熒光強度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):以抗壞血酸、碘和羅丹明B的順序加入時,體系最穩(wěn)定,且熒光強度相對較高,這是由于I3－和締合物羅丹明B-I3－與抗壞血酸之間的反應(yīng)速率存在差異,I3－與羅丹明B形成的離子締合物是疏水的,在溶液中很快沉淀[23],抗壞血酸無法與其完全反應(yīng)。試驗選擇以抗壞血酸、碘和羅丹明B的順序加入這3種物質(zhì)。

2.3 共存離子的影響

針對藥物中經(jīng)常使用的賦形劑、添加劑及水果中的共存物質(zhì),試驗選擇了淀粉、葡萄糖、糊精、乳糖和硬脂酸等干擾物質(zhì)以及Ca2＋、Mg2＋和Al3＋等陽離子進行干擾試驗。固定抗壞血酸用量,在優(yōu)化條件下進行干擾試驗。結(jié)果表明:測定誤差在±5%內(nèi)時,50倍的乳糖、硬脂酸、淀粉、糊精及100倍的上述3種金屬陽離子對測定結(jié)果均無干擾。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照試驗方法對抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進行測定,以抗壞血酸的濃度為橫坐標(biāo),與其對應(yīng)的熒光強度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:抗壞血酸的濃度在40μmol·L－1內(nèi)與其對應(yīng)的熒光強度之間呈線性關(guān)系,線性回歸方程為y＝5.330x＋33.81,相關(guān)系數(shù)為0.995 3。

以3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值計算方法的檢出限(3s/k)為5.6×10－9mol·L－1。

2.5 樣品分析

2.5.1 藥劑分析

取標(biāo)示量為50 mg/片的抗壞血酸片(維生素C片)5片,研磨后混合均勻,取其十分之一(相當(dāng)于25 mg)藥粉于小燒杯中,用水溶解并轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中,用水定容,所得溶液過濾后,取1.00 mL濾液,按照試驗方法進行測定,結(jié)果見表1。

取抗壞血酸注射液(2 mL,0.5 g/支)0.10 mL于250 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,混合搖勻。移取上述溶液1.00 mL,按照試驗方法進行測定,結(jié)果見表1。

試驗進一步對上述抗壞血酸片劑和抗壞血酸針劑樣品進行加標(biāo)回收試驗,每個加標(biāo)樣品平行測定6次,計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表1。

表1 實際樣品中抗壞血酸的分析結(jié)果(n＝6)Tab.1 Analytical results of ascorbic acid in substantial samples(n＝6)

由表1可知:抗壞血酸片劑樣品和抗壞血酸針劑中抗壞血酸的加標(biāo)回收率分別為97.4%,98.4%,測定值的RSD分別為2.3%,1.7%,說明方法具有良好的精密度。根據(jù)測定結(jié)果推算出樣品中抗壞血酸的含量,片劑抗壞血酸為49.63 mg/片,針劑抗壞血酸為0.51 g/支,與其標(biāo)示量基本一致,說明方法具有良好的準(zhǔn)確度。

2.5.2 果汁分析

分別采用本法和碘量法對橙汁味、蜜桃味和葡萄味等3種果汁飲料樣品進行測定,計算2種不同分析方法測定結(jié)果的相對誤差,結(jié)果見表2。

表2 抗壞血酸的測定結(jié)果Tab.2 Results of determination of ascorbic acid

由表2可知:所有樣品中實際測得抗壞血酸含量均在商品標(biāo)示含量范圍內(nèi),且相對誤差均小于5%。

羅丹明B-碘溶液體系間接測定抗壞血酸反應(yīng)現(xiàn)象明顯,操作步驟簡便,所得結(jié)果準(zhǔn)確,檢出限低,建立了一種靈敏度高、選擇性好、線性范圍較寬的測定抗壞血酸的方法。該方法在測定過程不使用任何有毒溶劑,相對于其他相關(guān)抗壞血酸的測定方法更環(huán)保。