冷輝 劉欣旭 張琦

水通道蛋白(aquaporin,AQP)通常分布于哺乳動(dòng)物及植物的細(xì)胞膜表面，是膜通道蛋白家族的成員,介導(dǎo)不同類(lèi)型細(xì)胞的跨膜水轉(zhuǎn)運(yùn)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了13種亞型，分別為AQP0～AQP12，他們分布于內(nèi)耳各個(gè)部位，各司其職，共同發(fā)揮協(xié)同作用[1]。梅尼埃病的病理改變是內(nèi)耳淋巴液代謝失衡，導(dǎo)致內(nèi)耳周?chē)鷿B透壓的改變，其原因可能與AQPs等水通道蛋白機(jī)能改變有一定關(guān)聯(lián)[2]。AQP0～AQP8對(duì)水的通透性較好，而AQP3、AQP7、AQP9對(duì)水的通透性較差，相反對(duì)油脂與尿素的通透性較好，且AQP1、AQP2、AQP5在內(nèi)耳表達(dá)較為豐富，故本研究選擇觀察AQP1、AQP2、AQP5在豚鼠內(nèi)耳膜迷路積水狀態(tài)下的表達(dá)及分布情況，探討其在內(nèi)淋巴積液中可能的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選擇健康紅目豚鼠60只，雌雄各半，反應(yīng)迅速，動(dòng)作靈活，隨機(jī)分為空白組(30只)和模型組(30只)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)均購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物科技有限公司[動(dòng)物批號(hào)：SCXK(京)2016-0003]，常規(guī)適應(yīng)飼養(yǎng)7天。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備 醋酸去氨加壓素(deammonia vasopressin acetate,dDAVP)，購(gòu)自深圳瀚宇藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：102117030。BSA、HRP Goat Anti Rabbit、蛋白、SD-PAGE凝膠試劑盒、超敏ECL化學(xué)試劑盒、Western及IP細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度試劑盒、BSA、DAB試劑盒、即用型SABC-POD試劑盒。Rabbit anti AQP1 antibody、Rabbit anti AQP2 antibody、Rabbit anti AQP5 antibody、Rabbit anti GAPDH antibody、Primer GAPDH、HRP Goat Anti Rabbit。

-80 ℃超低溫冰箱、恒溫水浴振蕩器、高速電動(dòng)勻漿器、移液器、電子顯微鏡、水平搖床、電泳儀、電泳槽、全自動(dòng)脫水機(jī)、低溫高速臺(tái)式離心機(jī)、全自動(dòng)酶標(biāo)儀、數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱、凝膠成像分析系統(tǒng)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1豚鼠耳蝸膜迷路積水造模 采用醋酸去氨加壓素造模的方式[3]，模型組予6 μg·kg-1·d-1醋酸加壓素連續(xù)腹腔注射10 d，空白組以1 ml生理鹽水腹腔注射10 d；常規(guī)飼養(yǎng)7天后取材。

膜迷路積水的判斷標(biāo)準(zhǔn)：正常情況下，耳蝸前庭膜與蝸管成約45°夾角，蝸管面積約占耳蝸總面積的1/3(圖1a)；當(dāng)膜迷路積水時(shí)，耳蝸的前庭膜向前庭階方向突出，同時(shí)蝸管的橫截面積也相應(yīng)增加,蝸管面積與耳蝸總面積比值增加。在光學(xué)顯微鏡下，將豚鼠耳蝸切片膜迷路積水的程度分為輕、中、重三度，蝸管面積占總面積的1/3～1/2為輕度積水(圖1b)；蝸管面積占總面積的1/2～2/3為中度積水(圖1c)；蝸管面積占總面積2/3以上為重度積水(圖1d)。模型組豚鼠耳蝸切片均出現(xiàn)不同程度的膜迷路積水，均造模成功，其中輕度6只，中度17只，重度7只；而空白組均未出現(xiàn)膜迷路積水。

1.3.2耳蝸取材 豚鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，剪斷胸骨，暴露出心臟，打開(kāi)顳骨，迅速斷頭取出聽(tīng)泡，放于固定液中室溫固定；10%EDTA脫鈣，每日換脫鈣液。用于Western-blot及熒光定量PCR的豚鼠，同上法麻醉后迅速直接斷頭取出聽(tīng)泡，放置于-80 ℃冰箱保存待用。每組各取5只(10耳)分別用于AQP1、AQP2、PQP5的免疫組化染色觀察，各5只用于Wstern-blot觀察。

1.3.3免疫組化方法檢測(cè)AQP1、AQP2、AQP5蛋白在耳蝸的分布 耳蝸組織固定脫鈣后，石蠟包埋，制備好耳蝸組織切片，長(zhǎng)度5 μm。隨后進(jìn)行脫蠟、抗原修復(fù)；PBS沖洗3次，然后滴加山羊血清，封閉10 min，去除封閉液，勿洗；直接滴加一抗工作液(1∶300稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜。PBS沖洗，5分鐘/次，共5次，隨后滴加二抗工作液(1∶500稀釋)，37 ℃恒溫水浴鍋中孵育90 min；PBS緩沖液沖洗，5 分鐘/次，共計(jì)5次。滴加DAB顯色液，室溫孵育10 min，PBS緩沖液沖洗，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸酒精分化，二甲苯透明后封片。在數(shù)碼顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野，采用生物信號(hào)采集系統(tǒng)測(cè)定每個(gè)視野的平均光密度值，以5個(gè)視野的平均值作為該樣本蛋白相對(duì)表達(dá)水平，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.4Western-blot法觀察AQP1、AQP2、AQP5蛋白在豚鼠耳蝸的表達(dá) 取適量耳蝸組織，剪碎，加入WB及IP細(xì)胞裂解液測(cè)定總蛋白濃度，計(jì)算上樣。電泳后進(jìn)行PVDF膜轉(zhuǎn)印，水平搖床室溫封閉1 h；滴加一抗(5% BSA封閉液1∶1 000稀釋)，4 ℃冰箱中，孵育過(guò)夜。次日清晨從冰箱中取出PVDF膜，用TBST緩沖液洗滌5次，5分鐘/次，滴加二抗(5% BSA封閉液1∶1 000稀釋)，平置于37 ℃恒溫水浴振蕩器中，孵育2 h。洗滌后，打開(kāi)凝膠成像分析系統(tǒng)中，將PVDF膜置于系統(tǒng)面板之上，充分滴加ECL發(fā)光液，與PVDF膜充分接觸(A液：B液為1∶1)，曝光，采集圖像，觀測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1免疫組化方法檢測(cè)AQP1、AQP2、AQP5蛋白在耳蝸的分布 兩組豚鼠耳蝸組織中AQP1蛋白主要表達(dá)于螺旋韌帶、螺旋神經(jīng)節(jié)、前庭膜、Corti器、血管紋、螺旋板等處；AQP2蛋白主要表達(dá)于螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、Corti器、血管紋等處；AQP5蛋白主要表達(dá)于Corti器、螺旋神經(jīng)節(jié)、內(nèi)外螺旋溝、螺旋韌帶等處(圖2～4)。與空白組比較，模型組豚鼠耳蝸中AQP1、AQP2蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.01)，AQP5蛋白表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05)，兩組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

圖2 免疫組化方法觀察豚鼠耳蝸組織中AQP1表達(dá)(×100)圖3 免疫組化方法觀察豚鼠耳蝸組織中AQP2表達(dá)(×100)圖4 免疫組化方法觀察豚鼠耳蝸組織中AQP5表達(dá)(×100)

表1 免疫組化方法觀察各組豚鼠耳蝸組織中AQP1、AQP1、AQP5表達(dá)的平均光密度值

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2Western-blot法觀察AQP1、AQP2、AQP5蛋白在豚鼠耳蝸的表達(dá) 由表2及圖5～7可見(jiàn)，模型組耳蝸中AQP1、AQP2蛋白表達(dá)含量較空白組明顯提高(P<0.01)，AQP5較空白組明顯降低(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 Western-blot法觀察各組豚鼠耳蝸組織中AQP1、AQP2、AQP5表達(dá)的平均光密度值

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖5 Western-blot方法觀察各組豚鼠耳蝸組織中AQP1表達(dá)圖6 Western-blot方法觀察各組豚鼠耳蝸組織中AQP2表達(dá)圖7 Western-blot方法觀察各組豚鼠耳蝸組織中AQP5表達(dá)

3 討論

AQPs作為水通道蛋白家族的成員，分布于人體多個(gè)器官及細(xì)胞，其對(duì)于水分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)起到了重要的作用，同時(shí)也對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)起到了一定的作用。AQPs在全身都有分布，尤其是與水液代謝相關(guān)的器官，目前確定在內(nèi)耳中有表達(dá)的水通道蛋白有AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP5、AQP6、AQP7和AQP9[4，5]。本研究通過(guò)醋酸加壓素建立豚鼠耳蝸膜迷路積水模型，選擇AQP1、AQP2、AQP5三種具有代表性的水通道蛋白，觀察這三種蛋白在內(nèi)耳表達(dá)的具體位置及表達(dá)量，從而探討其在豚鼠耳蝸膜迷路積水模型發(fā)生中可能的作用。

有研究報(bào)道AQP1主要分布于豚鼠耳蝸的基底膜、Corti器、內(nèi)外螺旋溝、骨迷路、內(nèi)淋巴管的纖維細(xì)胞、血管紋、螺旋韌帶、螺旋神經(jīng)節(jié)、內(nèi)淋巴囊、螺旋緣纖維細(xì)胞、橢圓囊壁、球囊壁等部位[3]。黃益燈等[6]發(fā)現(xiàn)在小鼠暈動(dòng)病模型中，注入AQP1 RNA毒性的抑制劑后，小鼠內(nèi)耳中AQP1表達(dá)量明顯下降。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)由腹腔注射醛固酮引起豚鼠膜迷路積水時(shí)，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，膜迷路積水的程度越來(lái)越重，AQP1的表達(dá)有所下調(diào)，而AQP2的表達(dá)相應(yīng)上調(diào)[7]。本研究結(jié)果顯示，AQP1蛋白主要分布于豚鼠耳蝸螺旋韌帶、螺旋神經(jīng)節(jié)、前庭膜、血管紋、Corti器、螺旋板等處，分布廣泛且量大，且模型組AQP1表達(dá)較空白組上調(diào)，有顯著差異(P<0.01)。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果有所差異，考慮可能不同種屬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之間AQP1的表達(dá)略有差異，另外，可能與不同研究所用的實(shí)驗(yàn)方法不同有關(guān)。

有報(bào)道稱(chēng)，AQP2蛋白主要表達(dá)在Corti器、血管紋、內(nèi)淋巴囊以及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中，而且在膜迷路積水的豚鼠內(nèi)耳中AQP2的表達(dá)較正常豚鼠增加[3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AQP2蛋白主要表達(dá)于螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、Corti器、血管紋等處；且模型組中AQP2表達(dá)量較空白組明顯上調(diào)(P<0.01)，與上述研究結(jié)果一致；內(nèi)耳中水的穩(wěn)定通過(guò)AVP-AQP2系統(tǒng)進(jìn)行的調(diào)節(jié)[8]，說(shuō)明AQP2的表達(dá)上調(diào)與豚鼠體內(nèi)注射醋酸去氨加壓素有關(guān)，內(nèi)耳中AQP2 mRNA的表達(dá)上調(diào)、V2R-cAMP-PKA-AQP2活化和內(nèi)淋巴囊內(nèi)AQP2的體內(nèi)捕獲與加壓素產(chǎn)生增加和內(nèi)淋巴吸收減少密切相關(guān),這可能是導(dǎo)致內(nèi)淋巴積水的原因[9，10]。

本研究結(jié)果顯示，AQP5蛋白主要分布于Corti器、螺旋神經(jīng)節(jié)、內(nèi)外螺旋溝、螺旋韌帶，與AQP1、AQP2蛋白相比表達(dá)較為局限；且模型組中AQP5蛋白表達(dá)較空白組下調(diào)，有顯著性差異(P<0.05)。Hirt等[11]研究發(fā)現(xiàn)AQP5的表達(dá)局限于直接與內(nèi)淋巴液體空間接觸的外溝細(xì)胞, 因此, 推測(cè)AQP5可能在與梅尼埃病有關(guān)的內(nèi)淋巴積水的形成中起作用。低頻聽(tīng)力下降是梅尼埃的典型表現(xiàn)之一，Mhatre等[12]研究發(fā)現(xiàn)AQP僅在耳蝸?lái)敾赜斜磉_(dá)，而非基底回，提示其表達(dá)變化與梅尼埃病的低頻聽(tīng)力下降有關(guān)。

AQP1、AQP2、AQP5蛋白在豚鼠耳蝸膜迷路積水中分布各有差異，表達(dá)含量也有所不同，它們共同發(fā)揮協(xié)調(diào)作用，參與內(nèi)淋巴積液的形成，但具體通過(guò)哪些方式及通路、各種蛋白發(fā)揮作用程度尚不明確，明確不同AQPs在內(nèi)耳的分布有助于為梅尼埃病研究提供參考。