杜 洋，王興華*，土繼政，韓 梅，郝 磊，郭西源，梁 華

(1.山西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)影像學(xué)系，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院超聲科，山西 太原 030001)

急性肝衰竭(acute liver failure， ALF)主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的原發(fā)性肝臟損害，無基礎(chǔ)肝病史，病情進(jìn)展快，死亡率高達(dá)50%以上，一直以來是臨床診治的難點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注[1-2]。因此，開發(fā)新的診療方法成為亟待解決的關(guān)鍵問題。剪切波彈性成像(shear wave elastography, SWE)是一種量化組織成像模式，可定量測量肝組織硬度。本研究采用硫代乙酰胺(thioacetamide, TAA)誘導(dǎo)建立ALF大鼠模型，之后以實(shí)時二維剪切波彈性成像(two-dimensional shear wave elastography, 2D-SWE)獲取肝組織彈性特征，并測量肝臟硬度值(liver stiffness measurement, LSM)，分析2D-SWE對于檢測ALF及預(yù)防性用藥治療后評估的價值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及造模方法 無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級雄性SD大鼠28只，體質(zhì)量220～250 g，由山西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。隨機(jī)分為4組，即對照組(8只)、模型組(8只)、乳果糖組(6只)和美常安組(6只)。參考文獻(xiàn)[3]造模方法，于實(shí)驗(yàn)第1～8天對乳果糖組和美常安組大鼠分別予以乳果糖[7 ml /(kg·d)]和美常安[100 mg /(kg·d)]稀釋后灌胃，對照組和模型組予以等量生理鹽水；實(shí)驗(yàn)第6、7天，模型組、乳果糖組和美常安組均腹腔注射TAA[200 mg /(kg·d)]，對照組注射等量生理鹽水。TAA由上海凜恩科技發(fā)展有限公司提供，乳果糖口服溶液和美常安由北京韓美藥品有限公司提供。

1.2 肌電圖檢查 采用DISA Keypoint肌電診斷儀，測量腦干聽覺誘發(fā)電位(brainstem auditory evoked potential, BAEP)。實(shí)驗(yàn)第8天監(jiān)測BAEP Ⅰ波的潛伏期及發(fā)生率，每項(xiàng)監(jiān)測指標(biāo)重復(fù)測量2次以上；以對照組BAEP Ⅰ波潛伏期±1.96s作為正常值，超過此值即診斷為輕微肝性腦病[3](minimal hepatic encephalopathy, MHE)。

1.3 超聲檢查 使用GE Logiq E9彩色多普勒超聲診斷儀，9L線陣探頭，頻率9 MHz，具備2D-SWE技術(shù)。麻醉大鼠后于前胸及腹壁備皮并保定，行常規(guī)超聲掃查。使探頭與掃查部位垂直并固定，避開肝內(nèi)管道結(jié)構(gòu)，選擇超聲診斷儀Elasto硬鍵，啟動Shear Wave，待圖像穩(wěn)定后凍結(jié)，選取肝左葉距離體表深度1.0 cm處0.2 cm2的ROI，重復(fù)測量10次，記錄LSM最大值、最小值和平均值。

1.4 血清學(xué)檢測 實(shí)驗(yàn)第9天，麻醉大鼠后經(jīng)腹主動脈無菌采血，行血清學(xué)檢測，檢測指標(biāo)包括血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、白蛋白及血氨。

1.5 病理學(xué)檢查 采血后處死大鼠，取肝左葉1 cm×1 cm×1 cm肝組織，使取材部位盡量與ROI取樣部位保持一致；以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，HE染色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。若連續(xù)性資料符合正態(tài)分布，以±s表示，采用t檢驗(yàn)或方差分析，組間比較采用LDS-t檢驗(yàn)；否則用中位數(shù)和四分位間距描述，以Mann-WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)分析，2組間比較采用Bonferroni校正的χ2檢驗(yàn)。采用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(intraclass correlation coefficient, ICC)檢驗(yàn)LSM的一致性，ICC<0.40一致性較差，0.40～0.75一致性一般，>0.75一致性良好。構(gòu)建ROC曲線，計(jì)算AUC。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模結(jié)果 實(shí)驗(yàn)第8天，模型組1只大鼠因藥物注射過量和/或個體耐藥性差死亡，7只存活；其余3組大鼠均存活。

2.2 肌電圖檢測結(jié)果 BAEP正常值為1.26 s。MHE發(fā)生率：模型組為85.71%(6/7)，乳果糖組、美常安組均為16.67%(1/6)。

2.3 血清學(xué)結(jié)果 4組血清學(xué)資料見表1。

2.4 大鼠肝臟病理 對照組大鼠肝臟病理示正常肝組織，光鏡下肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索呈放射狀排列在中央靜脈周圍。模型組大鼠肝組織肉眼觀普遍腫大，光鏡下表現(xiàn)為肝小葉結(jié)構(gòu)顯示不清，肝細(xì)胞水腫、變性壞死伴門管區(qū)炎細(xì)胞浸潤，肝竇受壓變窄或消失，肝中央靜脈淤血。乳果糖組和美常安組主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂肪變性及氣球樣變，炎癥壞死較模型組減輕，肝竇擴(kuò)張，部分可見點(diǎn)狀壞死，灶狀壞死不明顯，肝中央靜脈淤血。4組均未見明顯肝纖維化(圖1)。

表1 4組大鼠血清學(xué)資料比較(±s)

表1 4組大鼠血清學(xué)資料比較(±s)

組別谷丙轉(zhuǎn)氨酶(U/L)總膽紅素(μmol/L)白蛋白(g/L)血氨(mmol/L)對照組(n=8)56.99±8.446.13±1.6534.52±1.8034.18±11.93模型組(n=7)135.66±13.74*15.14±3.28*29.98±0.99*109.27±8.42*乳果糖組(n=6)113.39±14.19*#10.47±5.10*#30.81±2.11*63.49±8.95*#美常安組(n=6)121.09±12.16*#11.04±1.31*#30.88±1.34*61.67±4.83*#F值61.25410.51511.92984.481P值<0.01<0.01<0.01<0.01

注：*：與對照組比較P<0.05；#：與模型組比較P<0.05

圖1 4組大鼠肝組織病理表現(xiàn)(HE，×200) A.對照組表現(xiàn)為正常肝組織； B.模型組表現(xiàn)為以中央靜脈為中心的肝細(xì)胞壞死； C、D.乳果糖組和美常安組表現(xiàn)為脂肪變性及氣球樣變，炎癥壞死程度較模型組輕微

2.5 LSM一致性結(jié)果 2D-SWE測量LSM(10次)的ICC=0.96，一致性良好。

2.6 診斷效能 根據(jù)模型組LSM最大值、最小值和平均值所構(gòu)建的ROC曲線中，最大值和平均值的AUC相等，均為0.768(表2、圖2)；模型組LSM平均值高于對照組(P<0.05，表3)。以8.44 kPa為截?cái)嘀?，敏感度和特異度分別為100%和62.50%。

2.7 組間LSM平均值比較 對照組、模型組、乳果糖組及美常安組LSM平均值分別為(8.71±2.65)kPa、(11.86±2.74)kPa、(7.52±1.26)kPa和(7.57±0.76)kPa，模型組明顯高于其他3組(P均<0.05)，見圖3。

表2 模型組大鼠LSM值的診斷效能

表3 對照組和模型組大鼠LSM值比較(kPa)

3 討論

ALF為臨床常見的嚴(yán)重肝病癥候群。大鼠ALF模型的建立為臨床探索ALF病因和發(fā)病機(jī)制以及判

圖2 模型組大鼠LSM最大值、最小值、平均值的ROC曲線

圖3 肝臟彈性測量圖 A.對照組，LSM=6.55 kPa； B.模型組，LSM=12.09 kPa； C.乳果糖組，LSM=7.74 kPa； D.美常安組，LSM=7.84 kPa

斷療效等提供了重要工具[1-2]。目前國內(nèi)外主要通過注射肝毒性物質(zhì)和手術(shù)兩種方式建立ALF動物模型。TAA常用于制作ALF和肝纖維化模型，劑量以一次性腹腔注射TAA 200 mg/kg體質(zhì)量為佳[4]。本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射TAA建立大鼠ALF模型，大鼠血清學(xué)檢測結(jié)果和肝組織病理表現(xiàn)提示模型組大鼠肝功能受損及肝細(xì)胞壞死，BAEP監(jiān)測結(jié)果提示存在MHE，即制備ALF大鼠模型成功。早發(fā)現(xiàn)及對癥治療對改善ALF預(yù)后和提高生存率具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用微生態(tài)療法預(yù)防性治療ALF。乳果糖是指南公認(rèn)的經(jīng)典治療藥物，美常安是一種微生態(tài)制劑，兩種藥物均可改善ALF預(yù)后[5-6]，但缺乏評價療效的方法。

SWE是一種可以將組織量化的成像模式，通過定量測量肝組織獲得肝臟硬度值，為無創(chuàng)成像技術(shù)，已被多個指南推薦為診斷肝臟疾病的重要方法[7-8]，主要用于肝纖維化分期及肝硬化[9-10]，在ALF中應(yīng)用較少。LSM與炎癥和/或壞死程度密切相關(guān)，炎癥和/或壞死越嚴(yán)重，則LSM越高。2D-SWE具有能量場穩(wěn)定、信息量大、測量準(zhǔn)確、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。金潔玚等[11]將312例慢性肝衰竭和ALF患者分成好轉(zhuǎn)組和惡化組，2D-SWE檢測結(jié)果表明惡化組LSM高于好轉(zhuǎn)組，提示2D-SWE評估慢性肝衰竭和ALF患者預(yù)后的準(zhǔn)確率較高，LSM高于39.2 kPa時預(yù)后較差，反之預(yù)后較好，動態(tài)連續(xù)檢測對預(yù)后評估也有一定價值。

本實(shí)驗(yàn)采用2D-SWE測量LSM，定量評估組織硬度[12]，掃查時避免加壓探頭，以肘部作為支點(diǎn)，以提高測量的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)硬度圖無明顯顏色變化且近場無紅黃雜色豎條樣壓力偽像提示圖像可采用。測量結(jié)果顯示，模型組LSM高于對照組，預(yù)測ALF的截?cái)嘀禐?.44 kPa時，AUC、敏感度和特異度分別為0.768、100%和62.50%，具有較高的準(zhǔn)確率，提示測定LSM早期檢測在ALF中具有潛在應(yīng)用價值。本實(shí)驗(yàn)同時對ALF大鼠預(yù)防性用藥的效果進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)包括乳果糖組和美常安組在內(nèi)的2個治療組的LSM平均值均較模型組降低，而與對照組LSM平均值接近；肝組織炎癥壞死程度也較模型組明顯減輕，表現(xiàn)為肝細(xì)胞水腫、變性，細(xì)胞核被壓縮，細(xì)胞密度減低，可見少量炎癥反應(yīng)，表明2D-SWE測量LSM對于評估用藥后治療效果具有一定價值。

ALF肝臟硬度增加可能與肝細(xì)胞水腫、變性及炎癥壞死有關(guān)。研究[13-14]表明炎癥程度、血流灌注壓力、脂肪浸潤程度及細(xì)胞密度會影響肝臟硬度。本團(tuán)隊(duì)前期研究[15]發(fā)現(xiàn)炎癥壞死可能是組織硬度增加的重要因素之一。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)中ALF的病理改變，炎癥壞死可能是影響模型組大鼠LSM的最主要因素。

本研究的不足之處：①為動物實(shí)驗(yàn)研究；②以聲觸診組織量化技術(shù)進(jìn)行彈性成像時，取樣框與病理取材部位不可能完全一致。

綜上所述，ALF大鼠LSF增高；2D-SWE測量LSM對檢出ALF及評估預(yù)防性用藥效果具有潛在價值。