李富強(qiáng)，閆培勛，曹振華，李紹亮，李學(xué)思，郭淑平，張祥德

（河南省宋河酒業(yè)股份有限公司，河南鹿邑 477265）

紅曲菌是一種腐生真菌，具有典型霉菌的特征，喜暖喜濕，能形成分枝甚繁的菌絲體，呈肉眼可見的絨絮狀，呈紅色、褐色或無色，紅曲菌生活能力較強(qiáng)，在pH3～5 范圍內(nèi)均能生長，能耐受10%vol 乙醇，能在含25%甘油培養(yǎng)基中生長，能利用葡萄糖、麥芽糖、淀粉、甘油、山梨醇、乳酸等[1]。但其在分類學(xué)上又不屬于霉菌，紅曲菌在分類學(xué)上屬于真菌界、子囊菌門、真子囊菌綱、散囊菌目、紅菌科[2-3]。目前中科院微生物菌種保藏管理委員會正式收藏保存的紅曲菌有8 種共48 個菌株，常見紅曲菌種類有紅曲紅曲菌(M.anka)、紅色紅曲菌(M.ruber)、紫色紅曲菌(M.purpureus)、煙色紅曲菌(M.fuliginosus)、佛羅里達(dá)紅曲菌（M.floridanus）、血紅色紅曲菌（M.sanguineus）、叢毛紅曲菌（M.pilos)、橙色紅曲菌（M.aurantiacus)、血紅紅曲菌（M.sanguineus）和蒼白紅曲菌（M.pallens）等[4-5]。

紅曲菌廣泛分布于自然界中，能產(chǎn)生多種酶：淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、α-葡萄糖苷酶、酯化酶等。紅曲菌能產(chǎn)生紅黃兩系色素如紅曲玉紅胺、紅曲玉紅素、紅曲素、N-葡糖基紅斑胺、N-葡糖基紅曲紅胺、N-戊二?；t斑胺等。紅曲菌代謝產(chǎn)物也有桔霉素、莫納可林K、γ-氨基丁酸（GABA）等。

宋河酒業(yè)采用老五甑工藝，續(xù)米查配料，在不同米查次之間所產(chǎn)原酒質(zhì)量均有所不同。本實驗以宋河中高溫大曲為實驗材料篩選出1 株紅曲菌，以該株紅曲菌為研究對象生產(chǎn)酯化紅曲，在宋河酒業(yè)釀酒生產(chǎn)車間不同米查次添加不同質(zhì)量的酯化紅曲進(jìn)行實驗，為以后紅曲菌的生產(chǎn)試驗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

實驗原輔料：中高溫大曲，來自宋河酒業(yè)制曲車間；麩皮，市售優(yōu)質(zhì)麩皮。

試劑及耗材：氫氧化鈉，乳酸，鹽酸，酚酞，己酸，無水乙醇，葡萄糖，硫酸銅，10 g/L 次甲基藍(lán)溶液，pH4.6緩沖溶液，2.5 mol/L硫酸溶液，凡士林，牛肉膏，蛋白胨，瓊脂粉，麥芽浸粉，酵母膏等。

儀器設(shè)備：可見分光光度計（721 型，上海悅豐儀器儀表有限公司）；氣相色譜分析儀（GC102AT氣相色譜儀，安捷倫科技（中國）有限公司）；電子天平（MD200-3 型，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（101 型，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；真空抽濾裝置；電熱恒溫水浴鍋（HH-6型，金壇市金南儀器制造有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵(SHZ-D(Ⅲ)型，天津華鑫儀器廠)；電子萬用爐（DL-100 型，天津市泰斯特儀器有限公司）；搖床；試管；燒杯；玻璃棒等。

1.2 實驗方法

1.2.1 酯化紅曲制作流程

試驗采用以下流程進(jìn)行：純種紅曲菌→活化→種子培養(yǎng)基→擴(kuò)大培養(yǎng)→接種→盒子曲→酯化紅曲。

1.2.2 檢測方法

酯化紅曲檢測方法：水分采用電熱烘干法[6]，糖化力采用斐林試劑法[7]，酯化力采用皂化法[8]。

糟醅檢測方法：水分采用電熱烘干法[6]，淀粉采用斐林試劑滴定法[7]，酸度采用酸堿中和法[7]。

1.2.3 實驗方案

方案1：1#池、2#池和3#池添加紅曲量為投糧量5%，減少中高溫曲量為投糧量的2.5%。

方案2：實驗4#、實驗5#和實驗6#添加紅曲量為投糧量3.5%，減曲量為投糧量的1.75%。

方案3：實驗7#、實驗8#和實驗9#添加紅曲量為投糧量2.75%。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲菌篩選分離結(jié)果

以宋河中高溫大曲為實驗材料篩選紅曲菌，將中高溫大曲曲心處有粉紅色或紅色菌落的部位分別粉碎，加入一定量的無菌水，于150 r/min，30 ℃搖床上培養(yǎng)1 h 即成菌懸液，靜置1 h 后吸取1 mL上清液加入到9 mL 無菌水試管中，然后依次用無菌水稀釋至10-2～10-7，共7 個梯度，涂布在改良麥芽汁培養(yǎng)基平板上[9-10]。30 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，挑取具有紅曲菌基本形態(tài)特征的菌落，轉(zhuǎn)接到改良麥芽汁培養(yǎng)基斜面，相同培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)，采用繼代分離純化法進(jìn)行純化培養(yǎng)[11]。經(jīng)過多次反復(fù)純化培養(yǎng)后，將所得到的純菌種接種到用麥芽汁培養(yǎng)基制作的斜面進(jìn)行保藏。經(jīng)過多次篩選純化得到1株紅曲菌，保存于宋河酒業(yè)科研中心菌種保藏室。

2.2 酯化紅曲酯化力測定結(jié)果

篩選出的紅曲菌經(jīng)過純化后應(yīng)用于生產(chǎn)酯化紅曲。采用熟料麩皮培養(yǎng)酯化紅曲，生產(chǎn)出的酯化紅曲菌絲健壯豐滿，色澤紅亮，有一種特殊的酯香，檢測分析酯化紅曲酯化力與中高溫大曲酯化力的不同，其結(jié)果見表1。

表1 酯化紅曲與中高溫大曲酯化力結(jié)果

由表1 可知，酯化紅曲酯化力水分含量略高于中高溫大曲；酯化紅曲的酸度也略高于中高溫大曲；酯化紅曲的酯化力明顯高于中高溫大曲的酯化力，是中高溫大曲的3倍以上。

2.3 紅曲生產(chǎn)應(yīng)用實驗結(jié)果

2.3.1 實驗前后糟醅理化指標(biāo)

通過在酒糟中添加一定量的酯化紅曲并且相應(yīng)地減少一定量的中高溫大曲進(jìn)行試驗，實驗設(shè)計3 個方案，即方案1、方案2 和方案3，3 個試驗方案所添加酯化紅曲的量均不同，每個方案選擇3 條窖池進(jìn)行試驗。酯化紅曲除具有較強(qiáng)的酯化能力之外還能產(chǎn)生淀粉水解酶和蛋白酶，分解淀粉和蛋白質(zhì)等，影響糟醅殘余淀粉含量，酸度及水分含量。糟醅中的水分不僅是微生物生化反應(yīng)所必需的介質(zhì)、生長繁殖和代謝活動的必要條件，而且在產(chǎn)高質(zhì)量酒中起著重要作用[12]。糟醅中的酸可以提供有益微生物的營養(yǎng)和生成酒體中各種風(fēng)味物質(zhì)并促進(jìn)酯的生成[13]，試驗前后不同方案中酒糟理化分析結(jié)果見表2。

由表2 可知，方案1 中大米查糟醅出池水分相比于入池水分平均增加了18.41%，大米查糟醅出池酸度相比于入池酸度平均增加了2.81 倍，大米查糟醅出池淀粉相比于入池淀粉平均下降了54.84%；方案2 中大米查糟醅出池水分相比于入池水分平均增加了14.72%，大米查糟醅出池酸度相比于入池酸度平均增加了1.95 倍，大米查糟醅出池淀粉相比于入池淀粉平均下降了48.04%；方案3 中大米查糟醅出池水分相比于入池水分平均增加了14.69%，大米查糟醅出池酸度相比于入池酸度平均增加了1.82 倍，大米查糟醅出池淀粉相比于入池淀粉平均下降了41.18%。產(chǎn)酒過程中主要是把淀粉、蛋白質(zhì)等物質(zhì)分解成乙醇和水及一些呈香呈味物質(zhì)，糟醅淀粉下降速度越快，糟醅水分增加越多，產(chǎn)酒能力也越強(qiáng)。方案1 的淀粉下降速度最快、糟醅水分增加也最多，說明同等條件下方案1 產(chǎn)酒較多，這也間接說明酯化紅曲有增加出酒率的能力。

2.3.2 實驗窖池酒樣色譜結(jié)果及產(chǎn)量結(jié)果

由表3可知，方案1平均產(chǎn)量為339.81 kg，出酒率42.48%；方案1 所產(chǎn)原酒優(yōu)級酒中己酸乙酯含量平均為3.1734 g/L，相比于對照窖池己酸乙酯高了35.39%，四大酯總含量提高了33.11%，相比于對照窖池乳酸乙酯降低了34.72%；方案1 所產(chǎn)原酒三級酒中己酸乙酯含量平均為1.6793 g/L，相比于對照窖池己酸乙酯高了18.75%，相比于對照窖池乳酸乙酯降低了35.07%。

由表4可知，方案2平均產(chǎn)量為323.83 kg，出酒率40.48%；方案2 所產(chǎn)原酒優(yōu)級酒中己酸乙酯含量平均為3.1455 g/L，相比于對照窖池己酸乙酯高了34.20%，四大酯總含量提高了16.41%，相比于對照窖池乳酸乙酯降低了41.52%；方案2 所產(chǎn)原酒三級酒中己酸乙酯含量平均為1.6546 g/L，相比于對照窖池己酸乙酯高了17%，相比于對照窖池乳酸乙酯降低了49.22%。

表2 實驗前后糟醅理化指標(biāo)檢測結(jié)果

表3 方案1酒樣色譜分析結(jié)果及產(chǎn)量 (g/L)

表4 方案2酒樣色譜分析結(jié)果及產(chǎn)量 (g/L)

表5 方案3酒樣色譜分析結(jié)果及產(chǎn)量 (g/L)

由表5可知，方案3平均產(chǎn)量為300.38 kg，出酒率37.55%；方案3 所產(chǎn)原酒優(yōu)級酒中己酸乙酯含量平均為3.0460 g/L，相比于對照窖池己酸乙酯高了29.95%，四大酯總含量提高了18.85%，相比于對照窖池乳酸乙酯降低了37.05%；方案3 所產(chǎn)原酒三級酒中己酸乙酯含量平均為1.6530 g/L，相比于對照窖池己酸乙酯高了16.89%，相比于對照窖池乳酸乙酯降低了45.80%。

表6 混合酒樣色譜分析結(jié)果 (g/L)

2.3.3 感官嘗評結(jié)果

對所產(chǎn)基酒進(jìn)行感官嘗評[14]，由3 位國家級品酒師和5 位省級品酒師分別對白酒的色澤、香氣、口味、風(fēng)格進(jìn)行品評，并且根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[15-16]并結(jié)合實際情況進(jìn)行共同品評打分。其感官嘗評結(jié)果見表7。

表7 混合酒樣感官嘗評結(jié)果

由表6 與表7 可知，在釀酒生產(chǎn)過程中添加一定量紅曲，所產(chǎn)原酒中己酸乙酯含量明顯增加，乳酸乙酯含量明顯降低；在釀酒生產(chǎn)過程中添加一定量紅曲，其感官嘗評結(jié)果相對較好，復(fù)合香氣相比對照樣較好，綿柔度優(yōu)于對照樣；紅曲混合樣優(yōu)級相比于對照樣優(yōu)級己酸乙酯含量增加了32.47%，紅曲混合樣三級相比于對照樣三級己酸乙酯含量增加了15.91%；紅曲混合樣優(yōu)級相比于對照樣優(yōu)級乳酸乙酯含量降低了36.42%，紅曲混合樣三級相比于對照樣三級己酸乙酯增加了35.62%。

隨著紅曲添加量的增加，所產(chǎn)原酒中己酸乙酯含量也隨之增加，方案1與方案2 之間的差距較小，但均優(yōu)于方案3。綜合以上因素并結(jié)合綜合成本與效益初步認(rèn)定方案2 較好，即釀酒生產(chǎn)過程中添加紅曲量為投糧量3.5%，減曲量為投糧量的1.75%時原酒產(chǎn)質(zhì)量較好。

3 討論

本實驗以宋河中高溫大曲為實驗材料，選取曲心處呈紅色或粉紅色部位，通過富集，初篩復(fù)篩，并根據(jù)紅曲菌菌落形態(tài)特征及顯微鏡觀察初步確定1株紅曲菌。以熟料麩皮為小試培養(yǎng)基生產(chǎn)酯化紅曲，生產(chǎn)出的酯化紅曲菌絲健壯豐滿，色澤紅亮，有一種特殊酯香，且其酯化力是普通中高溫大曲酯化力的3倍以上。

通過在釀酒生產(chǎn)過程添加不同比例的酯化紅曲進(jìn)行實驗，結(jié)果表明，添加酯化紅曲的實驗窖池其原酒己酸乙酯和總酯含量明顯增加，原酒感官嘗評結(jié)果明顯較好，添加酯化紅曲的窖池所產(chǎn)原酒窖香濃郁，復(fù)合香氣好，綿柔度好，后味凈，風(fēng)格突出。3 種添加方案對比可知，方案1 和方案2 增加較為明顯，綜合以上因素并結(jié)合綜合成本與效益，初步認(rèn)定方案2 較好，即釀酒生產(chǎn)過程中添加紅曲量為投糧量3.5%，減曲量為投糧量的1.75%時，原酒產(chǎn)質(zhì)量較好。

本實驗為生產(chǎn)性實驗，濃香型白酒生產(chǎn)過程屬于開放性過程，可能會受到許多外界自然因素和人為因素的干擾。在以后的實驗過程中會盡量避免外界因素的干擾及增加平行試驗的次數(shù)，以確保實驗的準(zhǔn)確性、可靠性和可重復(fù)性。