劉 曉，劉廣瑞，隋 璐，胡錦榮，張京聲，劉 萍

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.吉林省酒精研究院有限公司，吉林長春 130022）

白酒作為我國傳統(tǒng)的蒸餾酒，是世界六大蒸餾酒之一，無論是生產(chǎn)技術(shù)還是產(chǎn)品風(fēng)格，都具有獨特的地位[1-2]。濃香型白酒是中國四大主要香型白酒之一，以瀘州老窖為代表，酒體醇厚綿甜，香味協(xié)調(diào)，尾凈余長，其主體香味是以己酸乙酯與適量的乳酸乙酯、乙酸乙酯和丁酸乙酯等構(gòu)成的復(fù)合香氣[3-4]。大曲是傳統(tǒng)發(fā)酵食品（如白酒、醋、醬油等）必不可少的糖化發(fā)酵劑。“曲乃酒之骨，好曲出好酒”“曲定酒型”，大曲在白酒釀造過程中起著非常關(guān)鍵的作用[5-8]。大曲不僅僅是重要的粗酶制劑和主要微生物來源，也是與產(chǎn)品風(fēng)味特征密切相關(guān)的釀造原料的一部分[9-10]。

目前，我國釀造白酒的原料主要有高粱、玉米、小麥等，以高粱為主，是由于高粱原料含有大量淀粉、適宜的蛋白質(zhì)、少量脂肪和單寧，以及本身含有的皮殼，有利于曲霉菌的糖化。但高粱產(chǎn)量較低，且單寧含量過高時，影響酒體品質(zhì)，而玉米單產(chǎn)較高，也是釀酒的優(yōu)良原料之一[11]。陳彬等[12]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵方式對白酒風(fēng)味的影響遠大于原料差異。而馬茹菲等[11]創(chuàng)新性的以玉米為主要原料，并按比例添加高粱，優(yōu)化釀造清香型白酒工藝。

由于傳統(tǒng)純糧固態(tài)釀造法，香氣成分豐富，但發(fā)酵周期較長，原料成本較高；而液態(tài)釀造法，前期糖化充分，可縮短發(fā)酵周期，且酒體純凈，但香氣成分不足[13]。本研究旨在結(jié)合傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵兩種釀造方式的優(yōu)點，以玉米為主要原料（玉米∶高粱=7∶3），加入液態(tài)發(fā)酵增香菌和大曲，探索半固態(tài)法釀造白酒的最佳發(fā)酵條件，為進一步探究半固態(tài)法釀造濃香型白酒的發(fā)酵機理以及實際生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：脫胚玉米面（天津市寶坻區(qū)百立旭糧食加工廠）；高粱為北京市售；增香菌為安琪生香活性干酵母（安琪酵母股份有限公司）；濃香大曲粉（姜氏養(yǎng)生保健產(chǎn)品公司）。

標(biāo)準(zhǔn)物：白酒色譜成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（內(nèi)標(biāo)/混標(biāo)），貴州計量研究院。

儀器設(shè)備：LRH-150 生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；GC2000 氣相色譜儀（日本島津公司）；TGC-16C 臺式離心機（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預(yù)處理

將高粱粉碎至6～8 瓣，粉碎粒度為20 目篩上部分約占70%；脫胚玉米面要求粒徑過20～40 目篩的比例約為30%；過40～60 目篩的比例約20%；60 目篩下部分約占50%。按玉米面∶高粱碎=7∶3 比例稱取，分別加入60%的冷卻水（以總干物料計）攪拌均勻，進行潤料。高粱碎于室溫條件下潤料12 h，大汽蒸料4 h，而玉米面于室溫條件下潤料0.5～3 h，大汽蒸料1 h，熟料揚涼至室溫，備用。該處理將高粱和玉米分開進行潤料、蒸料、揚涼。

1.2.2 半固態(tài)法釀造條件優(yōu)化

采用邊糖化邊發(fā)酵的方式，半固態(tài)法釀造濃香型白酒。稱取揚涼后的熟料，加入發(fā)酵劑和純凈水進行半固態(tài)發(fā)酵。主要工藝流程如圖1 所示。根據(jù)文獻[14]選擇發(fā)酵溫度、濃香型大曲添加量、增香菌添加量、料水比和發(fā)酵時間為影響蒸餾基酒品質(zhì)的主要單因素，以蒸餾基酒中己酸乙酯的含量為主要檢測指標(biāo)[15]，進行單因素試驗。以單因素分析結(jié)果為依據(jù)，確定正交試驗的主要因素和水平，優(yōu)化釀造工藝。

圖1 半固態(tài)法釀造濃香型白酒工藝流程

1.2.3 色譜條件

將發(fā)酵后的酒醅進行蒸餾，并對蒸餾白酒進行分段留樣。用酒精計對蒸餾酒基酒進行測量，使其在20 ℃下為53%vol，用于下一步分析。

色譜柱：DB-WAX 毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；升溫程序：初始溫度36 ℃，保持5 min后，以2 ℃/min 升溫至100 ℃，保持5 min，再以25 ℃/min 升溫至230 ℃，保持1 min；分流比30∶1；載氣（高純度N2）：1.2 mL/min；進樣量：1 μL。

1.2.4 統(tǒng)計分析

每個單因素試驗均設(shè)3 個重復(fù)實驗，利用單因素試驗和正交試驗獲得的最優(yōu)工藝條件進行發(fā)酵試驗，使用SPSS對試驗結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵溫度程序?qū)核嵋阴ズ康挠绊?/h3>

準(zhǔn)確稱取揚涼后熟料200 g（玉米∶高粱=7∶3）于無菌容器中混合均勻，加入25%濃香型大曲，3%增香菌（以干物料計，下同），總料水比為1∶3，混勻后放入恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)發(fā)酵，其中溫度設(shè)定如表1 所示。將發(fā)酵17 d 的酒醅蒸餾，并收集蒸餾液測定己酸乙酯的含量，結(jié)果見圖2。

表1 酒醅發(fā)酵過程的溫度設(shè)定

圖2 發(fā)酵溫度程序?qū)φ麴s基酒中己酸乙酯含量的影響

濃香型白酒的酒醅糖化發(fā)酵過程，主要可分為3 個階段。醇類、酸類和酯類物質(zhì)等是在多種微生物的共同作用下，經(jīng)過復(fù)雜的糖化、發(fā)酵過程產(chǎn)生的。第一階段是主發(fā)酵期，在少量氧氣的條件下，好氧細(xì)菌進行有氧呼吸消耗氧氣，淀粉在淀粉酶的作用下糖化為葡萄糖，而酵母菌進行大量繁殖；氧氣消耗完以后，酵母菌進行無氧發(fā)酵產(chǎn)生大量乙醇。該階段由于酒精發(fā)酵而產(chǎn)生大量能量，溫度先逐漸升高，隨后緩慢下降。產(chǎn)酸期是第二階段，無氧發(fā)酵除了酒精發(fā)酵，還能產(chǎn)生己酸、乙酸、乳酸等大量有機酸。酸類物質(zhì)的產(chǎn)生主要是細(xì)菌代謝活動的結(jié)果，此外酸類物質(zhì)既是白酒中呈香呈味物質(zhì)，也是酯類化合物的前體物質(zhì)，在酒醅中有著舉足輕重的作用。產(chǎn)香期是在酒精發(fā)酵結(jié)束時，前期積累的乙醇和大量有機酸在酯酶的作用下，酯化形成以己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯為主的酯類物質(zhì)和其他香味物質(zhì)[16]。

溫度是糖化發(fā)酵的主要影響因素之一，固態(tài)發(fā)酵升溫規(guī)律為“前緩升、中挺、后緩落”。本實驗發(fā)現(xiàn)該規(guī)律同樣適合于半固態(tài)發(fā)酵釀造濃香型白酒。這是由于糖化發(fā)酵過程中有多種微生物共同參與，主發(fā)酵期產(chǎn)生酒精的酵母菌最適溫度為28 ℃左右。而在產(chǎn)酸期時，己酸菌等細(xì)菌的最適溫度為32～35 ℃，部分產(chǎn)酒精的細(xì)菌最適溫度為36 ℃左右，生香期時產(chǎn)酯酵母在25～28 ℃時產(chǎn)酯能力最強[3]。但發(fā)酵過程中微生物代謝也會產(chǎn)生熱量，發(fā)酵溫度會在小范圍內(nèi)波動，這屬于正?，F(xiàn)象。由此，試驗設(shè)計了4 組溫控方案，根據(jù)不同的溫控方案分別進行發(fā)酵試驗，結(jié)果如圖2 所示。感官評價結(jié)合己酸乙酯含量檢測結(jié)果表明，溫控Ⅱ試驗組，蒸餾基酒無色清亮，香氣純正，醇甜協(xié)調(diào)，且己酸乙酯的含量最高，為0.584 g/L±0.013 g/L。溫控條件Ⅱ相比溫控Ⅰ恒溫發(fā)酵，己酸乙酯的含量增加了31.7%。該試驗結(jié)果與馬茹菲等[11]對清香型白酒溫控試驗結(jié)果趨勢相一致，溫控設(shè)置都遵循“前緩升、中挺、后緩落”的規(guī)律。在發(fā)酵過程中，溫度過高或者過低均會影響微生物的生長和代謝。因此，根據(jù)溫度對蒸餾基酒中己酸乙酯含量的影響試驗結(jié)果，選擇溫控條件Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ進行正交試驗，優(yōu)化試驗條件。

2.2 濃香型大曲添加量對己酸乙酯含量的影響

準(zhǔn)確稱取揚涼后熟料200 g（玉米∶高粱=7∶3）于無菌容器中，分別加入20%、25%、30%、35%、40%的濃香型大曲，3%的增香菌，按總料水比=1∶3 加入冷卻蒸餾水，混合均勻后放入恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)發(fā)酵，其中溫度按表1 中溫控條件Ⅱ設(shè)定。將發(fā)酵17 d 的酒醅蒸餾，并收集蒸餾液測定己酸乙酯的含量，結(jié)果見圖3。

圖3 大曲添加量對蒸餾基酒中己酸乙酯含量的影響

從圖3 可以看出，隨著大曲添加量的增加，蒸餾基酒中己酸乙酯的含量呈現(xiàn)先升高后緩慢下降的趨勢。當(dāng)大曲添加量為20%時，己酸乙酯的含量僅為0.526 g/L±0.021 g/L。當(dāng)大曲添加量為30%、35%時，蒸餾基酒中己酸乙酯的含量最高，最高含量為0.613 g/L±0.014 g/L。繼續(xù)增加大曲添加量為40%時，己酸乙酯的含量下降至0.575 g/L±0.025 g/L，相比最高含量下降了6.2%。由于酒醅的微環(huán)境對微生物的生長代謝有著重要的影響，而隨著大曲含量不斷增加，風(fēng)味前體物質(zhì)增加，同時酒醅中的微生物數(shù)量隨之增加，導(dǎo)致主發(fā)酵期和產(chǎn)酸期的微生物代謝產(chǎn)生大量酒精和有機酸等，從而對其他微生物活性產(chǎn)生影響，影響了己酸乙酯的生成。

2.3 增香菌添加量對己酸乙酯含量的影響

準(zhǔn)確稱取揚涼后熟料200 g（玉米∶高粱=7∶3）于無菌容器中，加入25%的濃香型大曲，分別加入2.5%、3%、3.5%、4%的增香菌，按總料水比=1∶3加入冷卻蒸餾水，混合均勻后放入恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)發(fā)酵，其中溫度按表1 中溫控條件Ⅱ設(shè)定。將發(fā)酵17 d 的酒醅蒸餾，并收集蒸餾液測定己酸乙酯的含量，以不添加增香菌為對照實驗，結(jié)果見圖4。

圖4 增香菌添加量對蒸餾基酒中己酸乙酯含量的影響

從圖4 可以看出，進行發(fā)酵試驗時添加增香菌有助于提高己酸乙酯的含量。隨著增香菌添加量的增加，蒸餾基酒中己酸乙酯的含量呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，但降低趨勢較平緩。當(dāng)增香菌的添加量為2.5%時，己酸乙酯的含量僅有0.501 g/L±0.018 g/L。而增加增香菌的添加量為3.5%時，己酸乙酯的含量最高為0.616 g/L±0.018 g/L，比添加2.5%增香菌時含量增加了22.9%。當(dāng)增香菌的添加量為4%時，己酸乙酯的含量為0.611 g/L±0.012 g/L，相比添加3.5%增香菌時的己酸乙酯含量下降了0.8%。該結(jié)果表明，酒醅中添加增香菌，可以提高己酸乙酯含量，從而可以增強白酒的醇甜口感和復(fù)合香氣。

2.4 料水比對己酸乙酯含量的影響

準(zhǔn)確稱取揚涼后熟料200 g（玉米∶高粱=7∶3）于無菌容器中，加入25%的濃香型大曲和3%的增香菌，分別按總料水比為1∶2.6、1∶2.8、1∶3.0、1∶3.2、1∶3.4 加入冷卻蒸餾水，混合均勻后放入恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)發(fā)酵，其中溫度按表1 中溫控條件Ⅱ設(shè)定。將發(fā)酵17 d 的酒醅蒸餾，并收集蒸餾液測定己酸乙酯的含量，結(jié)果如圖5所示。

圖5 料水比對蒸餾基酒中己酸乙酯含量的影響

從圖5 可以看出，隨著加水量的增加，蒸餾基酒中己酸乙酯的含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。其中，料水比為1:3.2 時，己酸乙酯的含量最高，為0.607 g/L±0.011 g/L，相比料水比為1∶2.6 時，己酸乙酯含量增加了21.6%。當(dāng)總料水比為1∶3.4 時，己酸乙酯含量為0.594 g/L±0.009 g/L，比該實驗組中己酸乙酯最高含量降低了2.2%。由此可知，發(fā)酵酒醅中含水量過低過高都會影響微生物代謝活動。

2.5 發(fā)酵時間對己酸乙酯含量的影響

準(zhǔn)確稱取揚晾后熟料200 g（玉米∶高粱=7∶3）于無菌容器中，加入25%的濃香型大曲，3%的增香菌，按總料水比為1∶3加入冷卻蒸餾水，混合均勻后放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)發(fā)酵，其中溫度按表1 中溫控條件Ⅱ設(shè)定。分別將發(fā)酵15 d、16 d、17 d、18 d、19 d、20 d 的酒醅蒸餾，收集蒸餾液測定己酸乙酯的含量，結(jié)果如圖6所示。

圖6 發(fā)酵時間對蒸餾基酒中己酸乙酯含量的影響

從圖6 可看出，隨著發(fā)酵時間的延長，蒸餾基酒中己酸乙酯的含量不斷增加，當(dāng)發(fā)酵時間為18 d時，己酸乙酯含量最高達到0.589 g/L±0.021 g/L，隨后己酸乙酯含量又逐漸下降。當(dāng)發(fā)酵時間為17 d和18 d 時，己酸乙酯含量均較高，17 d 己酸乙酯含量比18 d 低0.6%。但當(dāng)發(fā)酵20 d 時，己酸乙酯含量下降至0.552 g/L±0.025 g/L，比18 d 時的己酸乙酯含量低6.3%。這可能是因為發(fā)酵后期，酒醅中的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸減少，酒醅微環(huán)境也不斷發(fā)生變化，使己酸乙酯等香味物質(zhì)被消耗。此外，由于醇甜物質(zhì)如三羥基丁酮，2,3-丁二醇生成緩慢，可適當(dāng)延長發(fā)酵期，增加酒中的醇甜物質(zhì)，提升品質(zhì)。但發(fā)酵期過長，則會產(chǎn)生雜味及異香，會影響酒的品質(zhì)。綜合考慮，選擇18 d作為發(fā)酵終點。

2.6 正交試驗

以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，選取影響己酸乙酯含量的4 個主要因素，每個因素選擇3個水平（如表2），進行4 因素3 水平正交試驗。采用L9(34)進行正交設(shè)計，大曲添加量分別為25%、30%、35%；增香菌的添加量分別為3%、3.5%、4%；料水比分別為1∶3.0、1∶3.2、1∶3.4；發(fā)酵溫度分別為溫控Ⅱ、溫控Ⅲ、溫控Ⅳ，得到半固態(tài)法釀造濃香型白酒的最佳工藝條件（如表3）。

表2 正交試驗因素水平

表3 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

正交試驗結(jié)果表明，以白酒中己酸乙酯含量為評價指標(biāo)，各因素對結(jié)果影響的主次順序為D＞C＞A＞B，即發(fā)酵溫控條件＞料水比＞大曲添加量＞增香菌添加量，最佳發(fā)酵工藝條件為D1C3A2B2。綜合分析，確定最優(yōu)的半固態(tài)法釀造條件為大曲添加量30%、增香菌添加量3.5%、料水比為1∶3.2、發(fā)酵溫度為表1 中溫控條件Ⅱ。為檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，在最佳工藝條件下進行驗證試驗，結(jié)果表明，己酸乙酯的含量為0.660 g/L±0.015 g/L，該結(jié)果和試驗組5號結(jié)果相差0.3%，可認(rèn)為結(jié)果一致。

2.7 感官評價（表4）

表4 感官評價

以正交試驗確定的最優(yōu)工藝參數(shù)即大曲添加量30%、增香菌添加量3.5%、料水比為1∶3.2、發(fā)酵條件為溫控條件Ⅱ進行發(fā)酵試驗，采用0.1%活性炭吸附蒸餾基酒30 min，進行感官評價，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，蒸餾基酒色澤清亮透明，香氣相對純正，口味綿甜爽凈，并且具有明顯的本品風(fēng)格。

3 結(jié)論

本研究以玉米和高粱為釀酒原料，大曲和增香菌為糖化發(fā)酵劑，采用邊糖化邊發(fā)酵的方式優(yōu)化半固態(tài)法釀造濃香型白酒工藝條件。通過單因素試驗和正交試驗得出最佳工藝條件為大曲添加量30%、增香菌添加量3.5%、料水比為1∶3.2、溫控條件為第1 天為28 ℃，第2 天為33 ℃，第3 天30 ℃，4～18 d 時為25 ℃，發(fā)酵時間為18 d。在此工藝條件下蒸餾酒基酒中己酸乙酯含量為0.660 g/L±0.015 g/L，且蒸餾基酒顏色清亮，香氣較為純正，綿軟回甜，具有本品突出的風(fēng)格。本研究對于半固態(tài)釀造濃香型白酒的實際生產(chǎn)以及探索發(fā)酵周期短、酒體醇和、白酒品質(zhì)優(yōu)良的新型工藝具有一定的理論指導(dǎo)意義。