劉新輝 紀祥龍 孫艷麗* 王情情 周秀芝 李芳華 劉 梅 張 帥

(1.山東拜爾檢測股份有限公司，山東濰坊261000；2.山東省綠色食品發(fā)展中心，山東濟南250000）

β-受體激動劑在生物體內(nèi)具有“再分配效應”， 使用β-受體激動劑可以顯著增加動物骨骼肌的重量，同時減少脂肪的重量，但對整體的體重沒有顯著的影響，提高了飼料轉(zhuǎn)化率和胴體的瘦肉率，并可減少蛋白的分解，常見于畜禽養(yǎng)殖中的違法添加。但因添加劑量遠大于人類的治療劑量，家畜攝入后，較高的殘留量在體內(nèi)長時間殘留，人類食用后可能會產(chǎn)生行走不穩(wěn)、肌肉震顫、心律失常、惡心、暈眩等中毒癥狀，對高血壓、冠心病、甲狀腺功能亢進者影響尤為嚴重[1]。

喹噁啉類藥物是具有喹噁啉-N1，N4-二氧化物基本結(jié)構(gòu)的一類化學合成的動物專用藥，具有廣譜抗菌、提高飼料轉(zhuǎn)化率和增加畜禽瘦肉率的作用。藥物中的N→O 基團具有致癌、致畸、致突變性，在體內(nèi)脫氧代謝過程中伴隨氫氧自由基的產(chǎn)生，對細胞組織有很強的破壞作用，引起DNA損傷和毒害[2]。

在飼料β-受體激動劑和喹噁啉類的檢測過程中，樣品中的脂類物質(zhì)、蛋白質(zhì)、金屬離子會干擾待測物檢測，基質(zhì)增強效應或抑制效應會導致化合物的測試回收率與實際回收率相差很大，影響回收率的計算，導致測試數(shù)據(jù)與實際結(jié)果存在較大偏差?，F(xiàn)行標準NY/T 3145—2017《飼料中22種β-受體激動劑的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》、農(nóng)業(yè)部2086 號公告-5-2014《飼料中卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》中均采用固相萃取凈化。經(jīng)驗證：外加標樣品及陽性樣品與標準品的豐度比超出標準要求范圍，通過調(diào)整色譜分離條件依舊不滿足要求，表明凈化結(jié)果不理想，難以準確定性。

本研究采用Cleanert LipoNo 和Cleanert PSA進行凈化，較固相萃取凈化基質(zhì)去除率更高且豐度比滿足標準要求，并實現(xiàn)了飼料中20 種β-受體激動劑類和3 種喹噁啉類藥物的同時檢測，可在一定程度上解決復雜樣品基質(zhì)分析難的問題，并對飼料中2類藥物的檢測提供了新的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Cleanert LipoNo、Cleanert PSA（平均粒徑：40～60 μm；平均孔徑：60 ?；比表面：480 m2/g），購自天津博納艾杰爾公司；乙腈、甲醇、乙酸、乙酸銨均為色譜純，購自德國CNW公司；無水硫酸鈉、氯化鈉為分析純，購自中國國藥集團化學試劑有限公司；沙丁胺醇、萊克多巴胺鹽酸鹽、硫酸特布他林、馬布特羅鹽酸鹽，購自BePure公司；鹽酸克倫特羅、鹽酸班布特羅、克侖普羅、馬噴特羅鹽酸鹽、喹乙醇、卡巴氧，購自Dr.Ehrensorfer公司；齊帕特羅、西馬特羅、西布特羅、妥布特羅鹽酸鹽，購自WITEGA公司；氯丙那林、溴布特羅、噴布特羅鹽酸鹽、福莫特羅酒石酸鹽、克倫特羅內(nèi)標-D9、鹽酸萊克多巴胺-D6、沙丁胺醇-D3，購自曼哈格公司；利托君，購自TRC公司；喹烯酮，購自中國計量科學研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290Ⅱ-6460QQQ(配有電噴霧離子源(ESI)及Masshunter Quantitative B.08.00 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))，購自美國Agilent 公司；ME 240E 分析天平，購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；AS-E40UVT-R純水儀，購自重慶奧思德儀器設(shè)備有限公司；DG-2500R 多管漩渦混合儀，購自上海巴玖實業(yè)有限公司；N-EVAP112 氮吹儀，購自O(shè)rganomation Associates Inc 公司；3K15 冷凍離心機，購自德國sigma 實驗室離心機股份有限公司；Dispensette?Organic分液器，購自德國BRAND公司。

1.3 標準溶液配制

1.3.1 單一標準溶液的配制

分別稱取20 種獸藥標準物質(zhì)及3 種內(nèi)標標準物質(zhì)各10 mg（精確到0.01 mg）用甲醇溶解，定容至10 ml 容量瓶中，配制成1.0 mg/ml 的單一標準儲備液，-20 ℃下保存待用。

1.3.2 混合標準溶液的配制

從1.3.1 單一標準儲備液中各吸取0.5 ml 溶液于50 ml 容量瓶中，以甲醇將其稀釋定容為10 μg/ml 的混合標準中間液，吸取混合標準中間液0.5 ml 于50 ml容量瓶中，以甲醇將其稀釋定容為100 ng/ml的混合標準工作液，于4 ℃下避光保存；按同樣方式將3 種內(nèi)標物稀釋為100 ng/ml 的混合內(nèi)標工作液，于4 ℃下避光保存。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Agilent InfinityLabPoroshell 120 EC-C18色譜柱（3.0 mm×10 mm，1.8-Micron，薄殼型反相C18填料）；流動相：A 為5 mmol/l 乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸），B 為甲醇（含0.1%甲酸）；流速0.45 ml/min；柱溫35 ℃；進樣量2 μl；采樣梯度洗脫程序：0～1 min，

10% B；1～2 min，10% B～60% B；2～3 min，60% B；3～3.5 min，60% B～90% B；3.5～5 min，90% B；5～5.5 min，90% B～10% B；5.5～7 min，10% B。

1.4.2 質(zhì)譜條件

儀器系統(tǒng)配備三重四級桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI），正離子模式下多反應監(jiān)測（MRM）采集方式。干燥氣溫度為325 ℃，干燥氣流速為9 L/min，鞘氣溫度為350 ℃，鞘氣流速為10 L/min，霧化器壓力為35 psi，具體的質(zhì)譜條件如表1所示。

1.4.3 樣品前處理

制樣：抽取有代表性的飼料樣品，用四分法縮減取樣。粉碎后過0.45 mm孔徑的分析篩[3]，混勻，裝入磨口瓶中備用。

提?。簻蚀_稱取2.0 g樣品（精確至0.01 g）于50 ml具塞聚丙烯離心管中，加入內(nèi)標工作溶液100 μl，靜置10 min。加入5 ml 1%乙酸水溶液，渦旋混勻2 min后靜置10 min[4]。加入20 ml 1%乙酸乙腈，于渦旋振蕩器上劇烈振蕩10 min、40 ℃超聲提取10 min、再劇烈振蕩5 min，加入2 g 氯化鈉[5-6]，渦旋混勻2 min，在8 000 r/min條件下離心5 min。

表1 20種獸藥及3種內(nèi)標的質(zhì)譜檢測條件

凈化：移取10 ml 上清液于Cleanert LipoNo 凈化管中（凈化管中事先稱入2 g無水硫酸鈉、0.5 g Cleanert PSA[7]），渦旋混勻2 min，靜置分層。移取5 ml 上清液在40 ℃下氮氣吹干，加入1 ml 復溶液（甲醇∶乙腈∶水=1∶1∶8）渦旋溶解，過0.22 μm濾膜后待測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品凈化方式的優(yōu)化

Cleanert LipoNo為大顆粒填料，凈化后靜置1 min即可，無需離心，操作簡單。與傳統(tǒng)QuEChERS方法比較，簡化了操作步驟。在購置的Cleanert LipoNo 凈化管中稱入0.5 g Cleanert PSA，PSA有兩個氨基，pKa值分別為10.1和10.9，可與金屬離子產(chǎn)生螯合作用，用于提取金屬離子，有效降低了金屬離子導致的基質(zhì)效應。本研究與固相萃取凈化相比，無需特殊裝置、成本低、操作簡便、耗時短，符合當前高通量的發(fā)展趨勢。

2.2 樣品預處理條件的優(yōu)化

本試驗考察了乙腈、1%乙酸乙腈、1%乙酸水-1%乙酸乙腈3 種提取溶劑對提取效果的影響。結(jié)果顯示：1%乙酸水-1%乙酸乙腈做提取溶劑時，回收率最高且精密度最好，乙腈做提取溶劑時回收率最差。分析原因是因為乙酸水的水解作用及樣品經(jīng)過預先浸潤后目標物與提取溶劑的接觸面積增大[8]，故獲得了最高的提取效率。

部分飼料中蛋白質(zhì)含量較高，如不有效去除將影響目標物離子化并損傷色譜柱。沉淀蛋白質(zhì)的溶劑主要有酸、沉淀劑和有機溶劑。本研究考慮到目標物的溶解性、提取溶劑的浸潤性和與基質(zhì)固相分散萃取的兼容性，采用了有機溶劑沉淀法[9]，經(jīng)考察比較發(fā)現(xiàn)1%乙酸乙腈比1%乙酸甲醇效果好。

2.3 除脂填料的確定

飼料中脂類的去除程度將決定最終上機溶液的澄清度及基質(zhì)效應的強弱，比較了Cleanert LipoNo、Cleanert ODS C18、Captiva EMR-Lipid、乙腈飽和正己烷4種凈化方式。其中Cleanert LipoNo填料表面修飾了許多長的碳鏈，可針對性地吸附脂肪，對甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯均有高選擇性的吸附效果[10]，其分子結(jié)構(gòu)如圖1所示，可有效降低油脂引起的基質(zhì)效應。

C18 能有效吸附油脂，但需要經(jīng)過離心，且最終復溶液澄清度差，陽性樣品確證實驗的相對標準偏差大于28.9%，難以滿足法規(guī)要求；Captiva EMR-Lipid可高選擇性、高效地去除脂質(zhì)，而不會造成分析物損失。新型EMR-Lipid 技術(shù)結(jié)合了體積排阻和疏水相互作用[11-12]，在此基礎(chǔ)上實現(xiàn)脂質(zhì)去除，最大程度減少目標分析物的離子抑制，從而顯著提高方法的可靠性和耐用性；因飼料樣品種類多且基質(zhì)復雜，利用乙腈飽和正己烷凈化，極易發(fā)生乳化現(xiàn)象[13]，后續(xù)操作難以進行。本試驗研究了以上4 種凈化方式對飼料提取液凈化效果的影響，4 種不同填料分別稱取1 g，考察對甘油單油酸酯、辛酸甘油二酯、甘油三月桂酸酯的去除效率，結(jié)果如圖2 所示，可以看出，Cleanert LipoNo 和Captiva EMR-Lipid 可獲得較滿意的除脂效果，綜合考量成本和前處理的便捷性，確定Cleanert LipoNo為最佳的除脂填料。

圖1 甘油單油酸酯、辛酸甘油二酯、甘油三月桂酸酯的分子結(jié)構(gòu)

圖2 Cleanert LipoNo、Cleanert ODS C18、Captiva EMR-Lipid、乙腈飽和正己烷對脂質(zhì)的去除效率

2.4 基質(zhì)去除材料的確定

比較了Cleanert LipoNo+PSA（質(zhì)量比4/1）、C18+PSA（質(zhì)量比1/1）、PRIME HLB、氧化鋯、疏水體積排阻材料5 種基質(zhì)去除方式。以基質(zhì)最為復雜的配合飼料為試驗材料，把5種基質(zhì)去除材料的最終萃取物進行GC/MS 全掃描[14]，對全掃描色譜圖進行積分，計算得出了5種填料對樣品的基質(zhì)去除率分別為85%、70%、83%、55%、74%。結(jié)果表明5 種材料中，Cleanert LipoNo+PSA 能夠更有效地去除樣品中的基質(zhì)干擾。分析原因可能是因為Cleanert LipoNo+PSA 的組合高選擇性的吸附了油脂、有機酸、色素、金屬離子和酚類[15]。

2.5 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

目標物經(jīng)色譜分離時，流動相、進樣介質(zhì)、進樣體系、色譜柱類型均會影響色譜峰型。飼料提取液經(jīng)凈化后依舊存在復雜的干擾物，本研究所用色譜柱中的薄殼型反相C18 填料使目標物僅在表面薄殼內(nèi)進行吸附分配，通過降低擴散路徑改善了被分析物的傳質(zhì)效率[16]，提高了柱效，峰型更尖銳、靈敏度更高；使用純乙腈為進樣介質(zhì)時，會因溶劑效應造成峰分叉，最終確定甲醇∶乙腈∶水=1∶1∶8為最佳復溶液；使用甲醇-水作為流動相時，化合物色譜峰會拖尾、不對稱、靈敏度低，加入乙酸銨改善了分離度，加入甲酸促進了目標物的離子化，因此選擇5 mmol/l乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）-甲醇（含0.1%甲酸）為最佳流動相。

在液質(zhì)聯(lián)用中由于非揮發(fā)性組分與待測物質(zhì)在霧滴表面離子化的過程中會產(chǎn)生競爭，這種競爭可能會增強或者抑制被分析物離子的形成效能，也就是說被分析物離子的形成效能與進入電噴霧離子源的基質(zhì)密切相關(guān)[17]。本研究在質(zhì)譜儀采集方法中設(shè)置分段掃描，將目標物出峰前強極性的污染物切入廢液，避免其在離子源中的集聚，進一步降低了離子化過程中基質(zhì)干擾導致的基質(zhì)效應[18]。

2.6 方法學考察

2.6.1 線性范圍與定量限

完成前處理與儀器測定的優(yōu)化后，按1.4.3 的方法制備空白基質(zhì)溶液，并用此基質(zhì)空白溶液對混合標準工作液逐級稀釋成1、5、10、35、50 ng/ml 的系列標準溶液并依次進UHPLC-MS/MS 測定，X 軸設(shè)定為質(zhì)量濃度作為橫向坐標，Y軸設(shè)定為峰面積作為縱向坐標，由此完成標準曲線的繪制并進行線性回歸。所得結(jié)果表明：20種獸藥的濃度范圍為1～50 ng/ml時，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2取值范圍為0.990 3～0.999 1，具備試驗的可行性；同時，以S/N≥10確定β-受體激動劑類定量限為5 μg/kg、喹噁啉類定量限為50 μg/kg。

2.6.2 方法的準確度與精密度

分別選取配合飼料、濃縮飼料、精料補充料、添加劑預混合飼料陰性樣品基質(zhì)，根據(jù)定量限水平進行加標，按照確定的提取、凈化方法在選定的儀器條件下進行測定，每個濃度水平重復測定6 次，計算所得各種藥物的平均回收率、相對標準偏差范圍如表2 所示，可見方法的回收率高、重現(xiàn)性好。

表2 平均回收率、相對標準偏差范圍

2.7 與國家標準方法比較

與NY/T 3145—2017《飼料中22種β-受體激動劑的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》、農(nóng)業(yè)部2086 號公告-5—2014《飼料中卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》標準相比，無需固相萃取凈化，適用于大批量樣品的操作，即可作為篩查手段又可準確定性定量；所用試劑種類少且用量少，廉價易得，環(huán)境友好；β-受體激動劑類的標準定量限為10 μg/kg，本方法定量限為5 μg/kg；喹噁啉類標準定量限為200 μg/kg 或400 μg/kg，本方法定量限為50 μg/kg，定量限的降低除得益于儀器靈敏度的提高外，也進一步說明了凈化方法的除雜效果好，背景干擾低。

2.8 實際樣品的檢測

從市場上隨機購買了40 份飼料（配合飼料、濃縮飼料、精料補充料、添加劑預混合飼料各10 份）進行檢測，其中2 份飼料喹烯酮含量分別為4 670、1 880 μg/kg；1 份飼料克倫特羅含量為8.8 μg/kg。檢測過程中按2倍定量限進行加標，作為試驗過程中的質(zhì)控，喹烯酮回收率為90.6%，克倫特羅回收率為96.8%。陽性樣品的檢出及較高的回收率，進一步證明了方法的可行性和準確性。

3 結(jié)論

通過優(yōu)化樣品預處理條件、基質(zhì)去除材料、色譜和質(zhì)譜條件，建立了飼料中β-受體激動劑和喹烯酮類物質(zhì)的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。本方法前處理簡單、精密度高，Cleanert LipoNo與PSA相結(jié)合可有效去除脂質(zhì)與金屬離子，較低的基質(zhì)效應可有效降低檢出限并提高了定性準確性，是各類飼料中β-受體激動劑和喹烯酮類物質(zhì)含量水平檢測分析的有效方法。無論對承檢機構(gòu)還是企業(yè)內(nèi)部質(zhì)控，本研究方法在試劑耗材的購入、預處理方法及儀器方法的優(yōu)化設(shè)置上都較現(xiàn)行標準易于實行。更低的檢出限將更易檢出陽性樣品，更好的凈化效果將延長色譜柱壽命、減少對質(zhì)譜儀的污染并保證定性結(jié)果的準確性。