楊冰潔 李 濤 吳華蓮 向文洲 段元慧 吳后波*

（1.中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所 中國(guó)科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510301；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049；3.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510301；4.廣東海大集團(tuán)股份有限公司 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部微生態(tài)資源養(yǎng)殖利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州511400）

螺旋藻營(yíng)養(yǎng)豐富且均衡、蛋白質(zhì)含量高（超過(guò)干重的50%）、且富含水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)所需的維生素、礦物質(zhì)、多不飽和脂肪酸和必需氨基酸等[1-3]，可作為一種良好的飼料添加劑應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖和水產(chǎn)養(yǎng)殖中，但目前有關(guān)螺旋藻在飼料中的研究大部分都集中在淡水螺旋藻。與淡水螺旋藻相比，海水培養(yǎng)螺旋藻中的有效成分含量顯著提高，如藻藍(lán)蛋白、肌醇、可溶性多糖和各種微量元素等[4]，并且利用天然海水養(yǎng)殖螺旋藻能有效避免螺旋藻中重金屬離子富集與超標(biāo)，同時(shí)可以大幅度降低培養(yǎng)成本。而有關(guān)海水螺旋藻作為飼料添加劑的研究并不多見(jiàn)，其研究范圍也僅包括有限的幾個(gè)種類(lèi)，如在畜禽養(yǎng)殖中，飼料中添加海水螺旋藻可改善豬的生長(zhǎng)性能和肌肉品質(zhì)，并對(duì)仔豬的腹瀉有一定的治療作用[5]；不同添加量的海水螺旋藻對(duì)烏鬃鵝的生長(zhǎng)指標(biāo)和全凈膛率均有顯著性影響，并能提高肌肉蛋白質(zhì)品質(zhì)[6]，還能降低烏鬃鵝的肝臟毒性和總膽固醇含量，并在一定程度上提高免疫器官指數(shù)和血清總蛋白含量[7]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，適量的海水螺旋藻能明顯促進(jìn)彭澤鯽和改良鯽的生長(zhǎng)并提高其肌肉營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[8-9]，能改善長(zhǎng)臀鮠抗氧化和脂代謝水平[10]。因此，作為一種潛在的優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)與畜禽動(dòng)物飼料添加劑，海水螺旋藻具有良好的應(yīng)用前景，擴(kuò)大其研究范圍，將有助于水產(chǎn)和畜禽動(dòng)物養(yǎng)殖與海水螺旋藻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

凡納濱對(duì)蝦（Penaeus vannamei）（俗稱(chēng)南美白對(duì)蝦）肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，是亞洲最受歡迎的對(duì)蝦養(yǎng)殖品種之一，也是我國(guó)目前蝦類(lèi)的主要養(yǎng)殖品種[11]。但近些年隨著集約化養(yǎng)殖量的不斷增加，在養(yǎng)殖過(guò)程中出現(xiàn)了各種問(wèn)題，如種質(zhì)退化、病害等，給生產(chǎn)帶來(lái)了巨大損失[12]，而養(yǎng)殖病害的控制導(dǎo)致抗生素的大量使用，發(fā)展無(wú)抗養(yǎng)殖是今后飼料添加劑發(fā)展的重點(diǎn)方向。因此，通過(guò)飼料添加來(lái)提高凡納濱對(duì)蝦的非特異性免疫能力，提高其抗病性，已成為科研工作者的研究重點(diǎn)，已有大量關(guān)于凡納濱對(duì)蝦飼料添加劑的報(bào)道，如微生態(tài)制劑、中草藥等，均能明顯增強(qiáng)凡納濱對(duì)蝦的抗氧化和免疫防御能力[13-14]，但有關(guān)微藻如海水螺旋藻等作為飼料添加劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦的免疫影響的作用卻鮮有報(bào)道。

作為一種優(yōu)質(zhì)的畜禽和水產(chǎn)動(dòng)物飼料添加劑，海水螺旋藻可以促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)、提高肌肉品質(zhì)，并能增強(qiáng)動(dòng)物的機(jī)體免疫力，但是目前海水螺旋藻作為飼料添加劑的應(yīng)用還停留在比較初步的階段，需更多的研究進(jìn)一步探索。本研究以凡納濱對(duì)蝦為研究對(duì)象，旨在探究海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)成分和主要非特異性免疫能力的影響，為海水螺旋藻作為動(dòng)物飼料添加劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 海水螺旋藻藻粉及飼料制作

1.1.1 藻種

本試驗(yàn)中所用海水螺旋藻藻種為鈍頂螺旋藻SCSIO-45824 藻株，由中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所經(jīng)濟(jì)微藻種質(zhì)庫(kù)提供。

1.1.2 培養(yǎng)方法

SCSIO-45824 海水螺旋藻的培養(yǎng)采用修改后的南海-II號(hào)培養(yǎng)基[15]，培養(yǎng)基采用100%天然海水配置，在300 m2的跑道池進(jìn)行，所用海水從試驗(yàn)基地附近海域抽取，通過(guò)覆蓋顆?；钚蕴康纳盀V池過(guò)濾。跑道池培養(yǎng)中的葉輪攪拌轉(zhuǎn)速為13 r/min，藻液流速為0.3 m/s；培養(yǎng)物深度保持在20 cm左右。

1.1.3 戶(hù)外螺旋藻的采收與藻粉制作

當(dāng)螺旋藻培養(yǎng)至光密度（OD700）為1.2～1.5時(shí)進(jìn)行采收，采收時(shí)利用300目尼龍篩絹過(guò)濾，過(guò)濾物利用清水沖洗至少3遍去除各種無(wú)機(jī)鹽成分，將采收后的藻泥鋪開(kāi)，曬干后將其碾碎為粉末狀，室溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 飼料制作

飼料配方及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1，對(duì)蝦基礎(chǔ)飼料由豆粕、魚(yú)粉、面粉、蝦粉、魚(yú)油、花生麩、磷脂油等組成。將上述制作的海水螺旋藻粉按重量百分比0%（對(duì)照）、0.7%、2.1%、3.5%和5.0%添加于對(duì)蝦基礎(chǔ)飼料中，混勻后，制成粒徑為1.5 mm 的顆粒。自然晾干，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 凡納濱對(duì)蝦飼料配方及營(yíng)養(yǎng)水平(%)

1.2 養(yǎng)殖管理

試驗(yàn)蝦苗由廣東海大集團(tuán)提供，平均體重約為1.10 g，選擇體質(zhì)健壯、規(guī)格整齊的1 260尾試驗(yàn)蝦，隨機(jī)分組進(jìn)行養(yǎng)殖試驗(yàn)。試驗(yàn)共設(shè)7組（不同海水螺旋藻比例），每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)60尾蝦。試驗(yàn)在室內(nèi)反復(fù)循環(huán)流水式玻璃水族箱養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行。水族箱體積300 L，溶氧濃度控制在6 mg/l，溫度為25～28 ℃。試驗(yàn)開(kāi)始前，對(duì)蝦苗先在水族箱中以基礎(chǔ)飼料培養(yǎng)適應(yīng)14 d，每天投喂2次（上午9:00和下午15:00），養(yǎng)殖周期為56 d。

1.3 樣本收集與測(cè)定

1.3.1 樣本收集

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)一次性收集每個(gè)水族箱的對(duì)蝦，稱(chēng)重并記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)。每組取20 尾對(duì)蝦解剖得到肝胰腺，稱(chēng)重后迅速放入-20 ℃冷凍保存，用于堿性磷酸酶（APK）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）等指標(biāo)的測(cè)定，另外每組取15尾蝦肌肉用于營(yíng)養(yǎng)成分的分析。

1.3.2 測(cè)定方法

采用GB 5009.3—2010烘干法測(cè)定肌肉樣品的水分，采用GB 6432—86微量凱氏定氮法測(cè)定肌肉樣品的粗蛋白質(zhì)，粗脂肪含量采用索氏抽提法，二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）含量利用氣相色譜儀測(cè)定[16]。凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中蛋白質(zhì)含量、堿性磷酸酶（APK）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LYZ）和酚氧化酶（PO）的活力測(cè)定，均采用南京建成生物技術(shù)有限公司的試劑盒進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用Graphpad Prism 5.0 軟件，用One-way ANOVA 分析，選用Duncan's 法進(jìn)行多重比較，進(jìn)行單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示，P＜0.05表示差異性顯著。

2 結(jié)果

2.1 海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能如表2 所示。與對(duì)照組相比，5.0%組可以提高對(duì)蝦的重量，與對(duì)照組相比終重提高12.07%（P＜0.05），然而其余各組凡納濱對(duì)蝦的終重和增重?zé)o明顯提升效果，各組對(duì)飼料系數(shù)并沒(méi)有顯著性影響（P＞0.05）。

表2 海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

2.2 海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦肌肉營(yíng)養(yǎng)成分的影響

凡納濱對(duì)蝦肌肉的營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表3。與對(duì)照組相比，飼料中添加海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦肌肉中的水分含量無(wú)明顯影響（P＞0.05）；能夠顯著提高肌肉中粗蛋白的含量，分別提高了10.11%（P＜0.05）、7.40%（P＜0.05）、8.59%（P＜0.05）和10.90%（P＜0.05）；隨著海水螺旋藻添加量比例的增加，肌肉中粗脂肪含量呈下降趨勢(shì)，但差異不顯著(P＞0.05)；各試驗(yàn)組中DHA含量均有所提高，其中，提高最明顯的為5.0%比例添加組，提高了71.43%(P＜0.05)；試驗(yàn)組EPA含量也均有所提高，其中5.0%比例添加組提高最明顯，提高了60.0%(P＜0.05)。

表3 海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦肌肉營(yíng)養(yǎng)成分的影響(%)

2.3 海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫因子的影響

2.3.1 海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦堿性磷酸酶（AKP）活力的影響

海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰臟堿性磷酸酶（AKP）的影響如圖1。與對(duì)照組相比，0.7%、2.1%、3.5%和5.0%各組中AKP活力隨海水螺旋藻比例的增加而增加，其中5.0%組中AKP 活力顯著提高，提高31.98%（P＜0.05）。

圖1 不同水平的海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦AKP活力的影響

2.3.2 海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦溶菌酶(LYZ)活力的影響

海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰臟溶菌酶（LYZ）活力的影響如圖2 所示。與對(duì)照組相比，2.1%、3.5%和5.0%組中LYZ活力顯著提高，分別提高了147.47%（P＜0.05）、139.39%（P＜0.05）和137.37%（P＜0.05）。各組中LYZ活力隨海水螺旋藻添加量的增加而增加，至添加量為2.1%時(shí)達(dá)到最大值2.45 U/mg prot.，之后活力隨海水螺旋藻添加量的增加而略有降低。

2.3.3 海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦酚氧化酶（PO）活力的影響

海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰臟酚氧化酶（PO）活力的影響如圖3 所示。與對(duì)照組相比，0.7%、2.1%和5.0%組中PO 活力顯著提高，分別提高了35.36%（P＜0.05）、21.79%（P＜0.05）和31.78%（P＜0.05）。

圖2 不同水平的海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦LYZ活力的影響

圖3 不同水平的海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦PO活力的影響

2.3.4 海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦超氧化物歧化酶活力（SOD）的影響

海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰臟超氧化物歧化酶（SOD）活力的影響如圖4 所示。與對(duì)照組相比，0.7%和3.5%組中SOD 活力顯著提高，分別提高了27.49%（P＜0.05）和28.57%（P＜0.05）。

2.3.5 海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活力的影響

海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰臟谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活力的影響如圖5 所示。與對(duì)照組相比，0.7%組和3.5%組中GSH-Px 活力顯著提高，分別提高了10.81%（P＜0.05）和8.04%（P＜0.05），5.0%組中GSH-Px活力顯著降低，降低了10.46%（P＜0.05）。

圖4 不同水平的海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦SOD活力的影響

圖5 不同水平的海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦GSH-Px活力的影響

3 討論

3.1 飼料中添加海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性能的影響

本研究表明，飼料中海水螺旋藻添加量為0.7%～3.5%時(shí)對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)均有一定幅度的提高，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），高含量添加海水螺旋藻（0.5%）能顯著性促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)（P＜0.05）。鄭獻(xiàn)昌等[17]證明飼料中淡水螺旋藻添加水平對(duì)南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)性能無(wú)明顯地改善，表明海水螺旋藻具有更高的應(yīng)用前景。張華等[18]研究表明，飼料中添加適量螺旋藻能提高脊尾白蝦存活率、特定生長(zhǎng)率和吸收效率，虞為等[19]試驗(yàn)表明，飼料中添加螺旋藻可顯著提高花鱸特定生長(zhǎng)率和增重率，并顯著降低飼料系數(shù)。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是不同的養(yǎng)殖品種具有不同的營(yíng)養(yǎng)需求。

3.2 飼料中添加海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦肌肉營(yíng)養(yǎng)成分的影響

螺旋藻的蛋白質(zhì)水平與肉類(lèi)和大豆相似，除此之外它含有大量的維生素、礦物質(zhì)、酚類(lèi)、必需脂肪酸、氨基酸和色素，因此，對(duì)水生動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高[20]。在本試驗(yàn)中，海水螺旋藻的添加對(duì)凡納濱對(duì)蝦肌肉中的水分含量沒(méi)有顯著影響，與對(duì)照組相比，各海水螺旋藻添加組中粗蛋白含量有顯著性提高，海水螺旋藻不同百分比添加量各組間沒(méi)有顯著性差異。不同海水螺旋藻添加水平投喂凡納濱對(duì)蝦，對(duì)凡納濱對(duì)蝦肌肉中粗脂肪含量沒(méi)有顯著性影響。與對(duì)照組相比，5.0%組DHA 和EPA 含量顯著性提高（P＜0.05），其他各試驗(yàn)組DHA和EPA含量也有一定程度的提高。該試驗(yàn)結(jié)果與劉立鶴等[21]的試驗(yàn)結(jié)果大致相似，因此提高凡納濱對(duì)蝦蛋白含量?jī)H需添加低比例的海水螺旋藻即可。操玉濤等[22]研究結(jié)果說(shuō)明飼料中適量添加淡水螺旋藻可以顯著提高凡納濱對(duì)蝦EPA 和DHA 的含量，最適添加量為1.5%。本試驗(yàn)中海水螺旋藻各添加組對(duì)DHA 和EPA 含量均有提高，添加量在5.0%時(shí)DHA 和EPA 的含量達(dá)到最高。螺旋藻并不能合成EPA和DHA，而飼料中添加螺旋藻使凡納濱對(duì)蝦肌肉中EPA 和DHA 含量提高，說(shuō)明螺旋藻并不是EPA 和DHA 的直接來(lái)源，基礎(chǔ)飼料中的魚(yú)粉、魚(yú)油、磷脂油等是EPA 和DHA 的直接來(lái)源，可能是由于螺旋藻中某些活性因子有助凡納濱對(duì)蝦DHA 和EPA 的合成轉(zhuǎn)化或積累。

3.3 飼料中添加海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫的影響

凡納濱對(duì)蝦為低等的無(wú)脊椎甲殼動(dòng)物，肝胰腺參與體內(nèi)代謝、解毒和排泄等生理過(guò)程[23]，是一個(gè)非常重要的器官[24]，蝦體內(nèi)沒(méi)有特異性免疫系統(tǒng)，主要依靠非特異性免疫抵抗病原體入侵，體內(nèi)抗微生物因子主要是包括各種水解酶，如酚氧化物酶、溶菌酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶等[25-26]。在本試驗(yàn)中，飼料中添加海水螺旋藻后，除0.7%組外，其余各組中堿性磷酸酶活力均有不同程度的升高，并呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；各試驗(yàn)組中溶菌酶活力隨海水螺旋藻添加量的增加而增加，至添加量為2.1%時(shí)達(dá)到最大值，之后活力隨海水螺旋藻添加量的增加而略有降低，其中2.1%、3.5%組和5.0%組活力顯著提高（P＜0.05）；除5.0%組中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性顯著性降低（P＜0.05）之外，各組中酚氧化酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性均有一定程度的提高。幾種抗氧化酶的活力與螺旋藻添加劑量所呈現(xiàn)的規(guī)律性不強(qiáng)，特別是偶有出現(xiàn)海水螺旋藻高劑量添加下的活力降低，其主要原因可能是海水螺旋藻富含藻藍(lán)蛋白、SOD、谷胱甘肽、類(lèi)胡蘿卜素等高活性抗氧化的活性物質(zhì)，可以清除一部分由于環(huán)境應(yīng)激或病變所產(chǎn)生的氧化脅迫因子，對(duì)相關(guān)抗氧化酶形成了一定的功能補(bǔ)償機(jī)制，導(dǎo)致高添加劑量下不同幅度的下降。但總的來(lái)說(shuō)，飼料中添加海水螺旋藻可以提高凡納濱對(duì)蝦包括抗氧化活力在內(nèi)的非特異性免疫。

綜上所述，海水螺旋藻添加對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫有提高，可以不同程度提高堿性磷酸酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶和酚氧化酶活力，添加不同濃度的海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)、品質(zhì)均有不同程度的改善，綜合前述各方面的數(shù)據(jù)和分析，建議在凡納濱對(duì)蝦的養(yǎng)殖中添加海水螺旋藻2.1%～5.0%更為有益。本研究結(jié)果還表明，鑒于海水螺旋藻對(duì)凡納濱對(duì)蝦較為顯著的免疫增強(qiáng)和潛在的抗病害作用，有望作為無(wú)抗飼料候選添加劑，應(yīng)用前景廣闊，有待進(jìn)一步深入探討。

4 結(jié)論

綜上所述，飼料中添加2.1%～5.0%海水螺旋藻，可促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)，提高凡納濱對(duì)蝦肌肉中蛋白質(zhì)、DHA和EPA含量，增強(qiáng)凡納濱對(duì)蝦的非特異性免疫能力，說(shuō)明海水螺旋藻可作為凡納濱對(duì)蝦飼料添加劑應(yīng)用于實(shí)際養(yǎng)殖中，具有良好的應(yīng)用前景。