郭靜文 陳山多 馮雨薇 郭子華 吳 丹 邢程順 侯麗萍 舒 琥*

（1.廣州大學生命科學學院，廣東廣州510006；2.廣州大學環(huán)境科學與工程學院，廣東廣州510006）

當前我國的養(yǎng)殖業(yè)主要采取高密度養(yǎng)殖模式，由 于餌料只有部分被利用，養(yǎng)殖產生的殘餌、糞便極大污染了環(huán)境[1]。隨著環(huán)境污染的加劇以及養(yǎng)殖密度的增加，魚類生長過程中的健康問題日益突出。目前普遍利用一些藥物來治療魚類病害，但是細菌病毒對藥物的耐藥性日益增加，且這些藥物在水產品及環(huán)境中的殘留也威脅到人體的健康和安全，因此近年來許多學者通過益生菌對飼料中營養(yǎng)水平的調控來提高魚類免疫力[2-4]。

益生菌能調節(jié)水產動物腸道微生物平衡,提高免疫力，減少疾病產生，在水產養(yǎng)殖中起著很大的作用[5-8]。Gatesoup[9]將益生菌的概念應用到水產養(yǎng)殖上,認為益生菌是能夠進入動物腸道內，提高動物健康水平的一類微生物細胞。海洋紅酵母（Rhodotorulamucilaginosa）是從海泥中分離出的單細胞真核生物，是一類抗逆性較強的腐生菌[10]，海洋紅酵母作為生態(tài)養(yǎng)殖中廣泛應用的飼料添加劑，具有促進水生動物生長、顯著提高抗氧化能力、提高成活率和增強機體的非特異性免疫能力的作用[11]。本實驗通過在飼料中添加不同濃度的海洋紅酵母對寶石鱸（Scorturmbarcoo）生長、免疫的影響，為在寶石鱸及其他經濟魚類的飼養(yǎng)中推廣海洋紅酵母提供依據(jù)和指導。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

實驗飼料包括基礎飼料和海洋紅酵母飼料，海洋紅酵母飼料由基礎飼料和不同量的海洋紅酵母混勻制得。實驗用基礎飼料為“恒興牌”淡水魚膨化飼料，按照0.1%、0.3%和0.5%比例稱取海洋紅酵母菌粉制成海洋紅酵母濃度不同的實驗飼料（見表1）。海洋紅酵母由中國水產科學研究院南海水產科學研究所海利欣生物科技有限公司提供，活菌總數(shù)1010CFU/g。實驗飼料現(xiàn)配現(xiàn)用。

表1 實驗飼料組成

1.2 寶石鱸養(yǎng)殖

實驗所用寶石鱸幼魚來自上海觀星農業(yè)科技有限公司廣州東涌水產養(yǎng)殖基地，在廣州大學水產養(yǎng)殖實驗室暫養(yǎng)2周,穩(wěn)定之后開始實驗。選用12個規(guī)格相同的魚缸（長0.8 m×寬0.5 m×高0.45 m），挑選體質健康，規(guī)格整齊，體重差異小[平均體質量為(12.23±1.07) g，體長為9.52 cm]的寶石鱸作為實驗對象。實驗分4組，一組對照組（Control）只喂基礎飼料，實驗組分別添加0.1%(Diet1)、0.3%(Diet2)和0.5%(Diet3)濃度海洋紅酵母的基礎飼料喂食，每個組3 個重復，每個重復30 尾魚。每天投喂2 次，投喂時間分別為8:30 和16:30，飽食投喂，日投喂量為魚體質量的4%。每天觀察寶石鱸攝食情況。水體體積約為100 L，配合供氧機24 h增氧，配置水循環(huán)系統(tǒng)裝置，使水體條件保持在適宜溫度（21～25 ℃）、pH值（7.0～8.5）和DO(＞4.5 mg/l)。

1.3 解剖取樣

計算特定生長率、增重率、肥滿度、肝體指數(shù)和臟體指數(shù)。

特定生長率（SGR，%/d）=100×[In 終末體質量（g）-In初始體質量（g）]/時間（d）

增重率（WGR，%）=100×[終末體質量(g)-初始體質量(g)]/初始體質量（g）

肥滿度（CF，%）=100×體質量（g）/[體長（cm）]3肝體指數(shù)（VSI，%）=100×肝臟質量（g）/體質量（g）臟體指數(shù)（HIS，%）=100×內臟質量（g）/體質量（g）

1.4 樣品測試

1.4.1 血液免疫指標

將解剖取樣中得到的血清置于冰上解凍，使用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒測定血清總蛋白、白蛋白、超氧化物歧化酶（SOD）、堿性磷酸酶（AKP）、谷丙轉氨酶（AST）和谷草轉氨酶（ALT）。

1.4.2 肝臟抗氧化性能測定

第2,短信提醒及微信推送。護理人員每周需通過短信形式為患者發(fā)送骨科的相關問題,并督促患者按照護理計劃執(zhí)行各項操作。此外,護理人員可組織患者建立微信群,以便患者隨時咨詢相關問題;同時護理人員還可通過微信向患者推送疾病的相關知識及護理注意事項等。

寶石鱸肝臟抗氧化性能測定使用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定以下指標：總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）和過氧化氫酶（CAT）。

1.4.3 腸道消化酶活性

測定寶石鱸前腸、中腸和后腸消化酶活性，先將樣品置于冰上解凍，0.86%生理鹽水提前預冷至4 ℃，按照樣品質量∶體積=1∶4加入樣品并使用勻漿器攪碎至勻漿。離心機設置4 ℃、4 000 r/min離心30 min，將勻漿離心后，取上清液進行消化酶活性測定。腸道中淀粉酶活性用碘-比色法測定[12]，脂肪酶活性用聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法[13]。實驗試劑均使用南京建成生物工程研究所生產試劑盒。

1.5 攻毒實驗

飼喂8周后，每個處理取10尾魚用維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）活菌菌懸液（6.4×108CFU/ml）通過腹腔注射進行攻毒，每尾注射0.2 ml 然后置于干凈的水族缸內繼續(xù)飼養(yǎng)并觀察10 d，飼養(yǎng)條件和注射前相同，每天多次觀察和記錄寶石鱸的發(fā)病和死亡情況。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)使用Excel 整理并以“平均值±標準差”形式記錄，顯著性差異使用SPSS 23.0進行計算分析，P＜0.05表示顯著性差異，P＜0.01表示極顯著性差異。

2 結果

2.1 生長性能(見表2)

表2 添加不同濃度的海洋紅酵母對寶石鱸生長性能的影響

由表2可知，飼料中添加不同濃度的海洋紅酵母后對寶石鱸生長性能產生影響。0.3%組和0.5%組終末體質量較對照組有顯著提高（P＜0.05），0.1%組較對照組有增加但無顯著性差異。0.3%組增重率和特定生長率較對照組顯著提高（P＜0.05），其他三組無顯著性差異。實驗組肝體比較對照組顯著增加（P＜0.05）。臟體比各實驗組較對照組均無顯著性差異（P＞0.05）。0.1%組和0.3%組肥滿度較對照組顯著增加（P＜0.05），0.5%組較對照組無顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 攻毒結果（見圖1）

由圖1 可知，用維氏氣單胞菌攻毒實驗時，實驗組和對照組平均死亡率均在44 h后保持穩(wěn)定，對照組死亡率為93.3%，0.1%組、0.3%組和0.5%組死亡率分別為83.3%、70.0%和66.7%，0.3%組和0.5%組與對照組有顯著性差異（P＜0.05）。

圖1 維氏氣單胞菌對寶石鱸攻毒實驗死亡率的影響

2.3 血液免疫指標(見表3、表4)

表3 實驗4周時寶石鱸血液免疫指標

如表3、表4 所示，實驗4 周后，各實驗組AKP、白蛋白、總蛋白含量均有上升趨勢，相較于對照組，0.5%組AKP、白蛋白濃度顯著提高（P＜0.05）。SOD、AST、ALT及ALT/AST各實驗組和對照組無顯著性差異。實驗8周后，各實驗組SOD、AKP、白蛋白和總蛋白均有上升趨勢。相較于對照組，0.3%組和0.5%組SOD含量分別增加80.7%和134.5%。0.3%組AKP 較于對照組顯著增加（P＜0.05）。白蛋白含量0.3%組最高，但與對照組相比并無顯著性差異，總蛋白含量0.3%組最高，相較于對照組，0.3%和0.5%組總蛋白濃度均顯著提高。AST、ALT和ALT/AST均無顯著性差異，無統(tǒng)計學意義。

2.4 腸道消化酶(見表5、表6)

由表5、表6 所示，實驗4 周后，實驗組前腸淀粉酶、中腸淀粉酶較對照組都有增加，其中前腸淀粉酶0.5%組顯著增加（P＜0.05），中腸淀粉酶0.3%組和0.5%組分別增加113.3%和70.2%（P＜0.05）。后腸淀粉酶各實驗組和對照組無顯著性差異。實驗8 周后，前腸淀粉酶和后腸淀粉酶0.3%組均值最高，但各組無顯著性差異。中腸淀粉酶0.3%組最高，較對照組差異顯著（P＜0.05）。表7、表8 所示，實驗4 周和實驗8 周后，前腸0.3%組脂肪酶較于對照組均顯著增加（P＜0.05），中腸、后腸脂肪酶較對照組無顯著性差異。

表5 實驗4周時寶石鱸腸道淀粉酶活性(U/mg prot.)

表6 實驗8周時寶石鱸腸道淀粉酶活性(U/mg prot.)

表7 實驗4周時寶石鱸腸道脂肪酶活性(U/mg prot.)

表8 實驗8周時寶石鱸腸道脂肪酶活性(U/mg prot.)

2.5 肝臟免疫

如表9、表10 可知，實驗4 周后，實驗組T-AOC、CAT、GSH 和SOD 值較對照組均有增加，0.3%組TAOC、GSH 和CAT 值較對照組顯著增加（P＜0.05），其他實驗組均有增加，但無顯著性差異。0.1%組和0.3%組SOD 值顯著高于對照組（P＜0.05）,0.5%組較對照組無顯著性差異。

實驗8 周后，0.1%組和0.3%組較對照組T-AOC值分別增加了90.6%和159.4%，差異顯著（P＜0.05），0.5%組較對照組有增加但無顯著性差異。0.3%組GSH、CAT、SOD 均顯著高于對照組（P＜0.05），其他組較對照組都有增加，但沒有顯著差異（P＞0.05）。

表9 實驗4周時寶石鱸肝臟抗氧化性能

表10 實驗8周時寶石鱸肝臟抗氧化性能

3 討論

本實驗中，基礎飼料中加入海洋紅酵母，對寶石鱸的生長性能有積極的影響，能提高增重率、特定生長率和肥滿度。夏冬梅等[14]研究表明在飼料中添加海洋紅酵母可以促進羅非魚（Oreochromis niloticus）生長、降低飼料系數(shù)、提高消化酶活性和增強非特異性免疫。尹安偉等[15]在飼料中加入海洋紅酵母，可以顯著增加對蝦的終末質量，并且可以提高日本對蝦（Penaeus japonicus）幼體的成活率，促進其生長發(fā)育。Hien Van Doan 等[16]向羅非魚飼料中添加不同水平乳酸菌和芽孢桿菌，探究分別對羅非魚生長、免疫的影響；張瑞玲等[17-18]報道了在大菱鲆（Scophthalmus maximus L.）基礎飼料中分別添加0、0.5、1.0 g/kg 和1.5 g/kg 的海洋紅酵母，比較各實驗組和空白組特定生長率、相對增重率、攝食率和餌料系數(shù)均未發(fā)現(xiàn)顯著性差異，說明在基礎飼料中添加該濃度的海洋紅酵母對大菱鲆的生長性能和攝食無影響。以上對飼料中添加海洋紅酵母研究結論不一致的原因可能跟魚的種類、海洋紅酵母的種類、魚的養(yǎng)殖周期和養(yǎng)殖方式的不同有關系。

血清總蛋白、白蛋白和球蛋白是血液中的重要化合物，反映了蛋白質代謝水平的情況，血清蛋白是指魚類是否健康的重要免疫參數(shù)[19]。實驗組魚在喂養(yǎng)4 周和8 周時血液蛋白含量相對對照組都有上升，說明海洋紅酵母可以提高魚體內蛋白質代謝能力。魚類容易受到氧自由基的影響，超氧化物歧化酶（SOD）是機體抗氧化酶系統(tǒng)的主要作用成分之一，可對抗和阻斷因氧自由基對細胞的損害，并及時修復受損細胞，恢復原自由基造成的對細胞傷害，反映機體的抑制氧自由基的能力[20]。堿性磷酸酶（AKP）是在所有生物體中參與許多重要功能的一種調控酶，可以破壞有害物質的表面分子組成，加快有害物質降解，防止病菌的繁殖[21]。本實驗進行8周時，與對照組相比，0.3%組的SOD 和AKP 顯著增加，AST 無顯著性差異，說明0.3%組魚體抗氧化能力和對有害物質的降解能力更強，這可能與血清蛋白的提高有關系。谷丙轉氨酶（AST）和谷草轉氨酶（ALT）是魚類線粒體中廣泛存在的轉氨酶，是診斷肝臟功能和損傷的重要參數(shù)。本實驗各組中轉氨酶均無明顯變化，說明在基礎飼料中添加海洋紅酵母不會對肝功能有損害作用。

海洋紅酵母中含有豐富的維生素E 和類胡蘿卜素[22]。類胡蘿卜素有提高免疫力的作用，對消除自由基和維護細胞膜穩(wěn)定性有作用[23]。類胡蘿卜素可以提高魚類的非特異性免疫因子血清溶菌酶的活力，從而通過提高魚類的非特異性免疫來提高其生長性能[24]。這可能是在基礎飼料中添加海洋紅酵母血液和肝臟中抗氧化物質增多，自由基減少的原因。肝臟中總抗氧化能力（T-AOC）是魚體、酶抗氧化系統(tǒng)和抗氧化酶系統(tǒng)的綜合反映，用于完成抗氧化作用，其與健康狀況相關聯(lián)。還原型谷胱甘肽（GSH）是主要的抗氧化劑，參與生物體系中對抗脂質過氧化的防御機制。過氧化氫酶（CAT）通過催化過氧化氫分解為水和分子氧，達到清除自由基，降低脂質過氧化氫損害的作用。本次實驗中實驗組T-AOC、GSH 和CAT 的提高，說明海洋紅酵母可以提高酶抗氧化能力，減少了自由基對魚體的損害。

外界環(huán)境和飼料容易對魚類腸道消化酶產生影響，飼料不僅可能影響腸道消化酶活性和分布，還可能對消化酶的分泌產生影響，飼料中營養(yǎng)物質的組成會對消化酶產生影響，消化酶的活性受蛋白質的含量影響，腸道淀粉酶和脂肪酶受脂肪含量的影響[25]，寶石鱸腸道淀粉酶和脂肪酶活性可以反映其對營養(yǎng)物質的消化和吸收的能力。本實驗中淀粉酶和脂肪酶活性在實驗組有提高，這表明海洋紅酵母對寶石鱸產生了積極作用，提高了寶石鱸對營養(yǎng)物質的消化和吸收。楊世平等[26]研究發(fā)現(xiàn)沼澤生海洋紅酵母（Rhodosporidium paludigenum）對凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）胰腺分泌的蛋白酶和淀粉酶有促進作用（P＜0.05）。綜上，海洋紅酵母提高寶石鱸腸道淀粉酶和脂肪酶活性的作用機理可能是：①海洋紅酵母可以改善腸道菌群生態(tài)平衡，促進有益菌的繁殖，抑制有害菌，促進新陳代謝從而增強相關消化酶的合成；②海洋紅酵母在腸道內產生淀粉酶和脂肪酶等消化酶類物質。

4 結論

基礎飼料中添加海洋紅酵母可以促進寶石鱸的生長，提高魚體的抗氧化能力減少自由基的損害、增強肝臟抗氧化能力、并對肝臟無損害作用，海洋紅酵母還對腸道淀粉酶和脂肪酶活性有促進作用，其中添加0.3%的海洋紅酵母組效果最佳，在寶石鱸的基礎飼料中建議添加量為0.3%。