馮 沖,李婼雯,夏 雪, 頓弘斌,田嘉興

(鄭州工程技術(shù)學(xué)院 化工食品學(xué)院，河南 鄭州 450044)

纖維素酶在食品、飼料、紡織、醫(yī)藥、造紙及洗滌劑等行業(yè)[1]有廣泛應(yīng)用價(jià)值，但酶用量大、成本高,在一程度上限制了其生產(chǎn)應(yīng)用。纖維素酶在自然界的分布非常廣泛，存在于微生物、某些脊椎動(dòng)物，甚至是高等植物體內(nèi)[2]。自然界中纖維素類物質(zhì)的生物降解主要依賴于產(chǎn)纖維素酶的微生物來(lái)完成[3]，能產(chǎn)生纖維素酶的微生物主要有細(xì)菌、真菌、放線菌等。纖維素酶產(chǎn)生菌的自然篩選是從自然界中獲得野生菌株，是菌株選育工作的最原始、最基礎(chǔ)的方法[4-5]，也是構(gòu)建菌種數(shù)據(jù)庫(kù)的有效方法。本文從黑胸散白蟻腸道內(nèi)篩選出來(lái)一株產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌，命名為F8[6]，對(duì)其產(chǎn)酶發(fā)酵工藝和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芽孢桿菌F8菌株：來(lái)自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；種子液培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，蒸餾水1000 mL，調(diào)pH至7.0，121℃滅菌20 min；發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，稻草秸稈粉0.5%，蒸餾水1000 mL。121℃滅菌20 min。

乙酸-乙酸鈉緩沖溶液 (pH=4.8)：0.1 M醋酸溶液和0.1 M醋酸鈉溶液以46的體積比混合，低溫冷藏備用；DNS染色試劑[7]：溶液A(分析純NaOH 104 g，溶于1300 mL水中，加入30g分析純3，5-二硝基水楊酸)和溶液B(分析純酒石酸鉀鈉910 g，溶于2500 mL水中，加入25 g無(wú)水亞硫酸鈉)混合后加入1200 mL水，暗處放置一星期后使用。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別吸取1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，依次放入15 mL比色管中，補(bǔ)加水至2.0 mL，加入2.0 mL DNS試劑，具塞，沸水浴中反應(yīng)10 min，冷卻后定容至15 mL。分光光度計(jì)550 nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值，3次重復(fù)試驗(yàn)的均值用最小二乘法擬合y=ax+b一元線性方程，由光密度值引得葡萄糖量。

FPA和CMC酶活的測(cè)定參照文獻(xiàn)[8-9]進(jìn)行。

1.2.3 粗酶的提取

取發(fā)酵液1.5 mL，4 000 r/min離心10 min，取上清液，即得粗酶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，回歸方程為y=1.8219x-0.053，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9994。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 最佳碳源的確定

初始培養(yǎng)基分別以0.5%(質(zhì)量百分比)玉米秸稈、稻草、微晶纖維素、麩皮、葡萄糖、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、可溶性淀粉作為碳源。接種量5%，初始pH7.5，35℃，150 r/min發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)2 d ，測(cè)定發(fā)酵粗酶液的CMC酶活和FPA。結(jié)果顯示篩選菌株F8對(duì)碳源的利用比較廣泛，其中以CMC-Na為碳源時(shí)酶活力最高，CMC酶活和FPA分別是為0.032 U/mL,0.048 U/mL。因此，確定CMC-Na為最佳碳源。

2.3 最佳氮源的確定

以CMC-Na為主碳源，分別以1%(質(zhì)量百分比)蛋白胨，酵母粉，牛肉膏，豆粕粉，稻草，尿素，(NH4)2SO4, (NH4)2HPO4，1%蛋白胨+1%酵母粉為氮源，接種量5%，初始pH7.5，35℃，150 r/min發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)2 d ，測(cè)定發(fā)酵粗酶液的CMC酶活和FPA。結(jié)果顯示菌株F8對(duì)氮源的利用也很廣泛，尤其以牛肉膏為氮源時(shí)FPA最高，為0.039 U/mL(此時(shí)CMC酶活為0.028 U/mL)；以豆粕為氮源時(shí)CMC酶活最高，為0.031 U/mL(此時(shí)FPA為0.031 U/mL)?？梢钥闯觯珻MC酶活與FPA的相對(duì)最高值不能在同一氮源條件下取得。由于豆粕的成本較低，綜合考慮以豆粕為最佳氮源。

2.4 最佳接種量的確定

分別以2%，4%，6%，8%，10%，12%，14%，16%，18%及20%的接種量，將種子培養(yǎng)液接種于100mL產(chǎn)酶培養(yǎng)液中，初始pH7.5，36 ℃，150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)2 d，測(cè)定各接種量條件下粗酶液的CMC酶活和FPA，結(jié)果如圖2所示。

圖2 接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響

由圖2可知，當(dāng)接種量為6%左右時(shí)，CMC酶活與FPA都相對(duì)較高，分別達(dá)0.0162 U/mL和0.0245 U/mL。因此，確定6%為最佳接種量。

2.5 最佳裝液量的確定

在300 mL三角瓶中分別裝入40，60，80，100，120，140，160，180及200 mL發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，接種量6%，初始pH7.5，36 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)2 d，測(cè)定各條件下粗酶液的CMC酶活和FPA，結(jié)果如圖3所示。

國(guó)務(wù)院總理周恩來(lái)1974年做出批示：“天然氣進(jìn)京，把首都變成空氣最干凈，街道最清潔，環(huán)境最優(yōu)美的城市。”把華北油田的天然氣引進(jìn)北京城，這是周總理生前愿望，也是廣大石油工人的多年夙愿。

圖3 裝液量對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響

由圖3可知，裝液量在60 mL時(shí)，CMC酶活與FPA都相對(duì)較高，分別為0.0164 U/mL和0.0208 U/mL。說(shuō)明充足的氧氣有利于提高菌體的酶活，其中60 mL裝液量為最佳。

2.6 最佳pH的確定

按6%的接種量，將種子培養(yǎng)液接種于60 mL產(chǎn)酶發(fā)酵液中，初始發(fā)酵液的pH分別調(diào)至5.0，6.0，7.0，8.0，9.0。36 ℃，150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)2 d，使菌株發(fā)酵產(chǎn)酶，測(cè)定各pH時(shí)粗酶液的CMC酶活與FPA，結(jié)果如圖4所示。

圖4 pH對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響

由圖4可知，發(fā)酵液初始pH的變化對(duì)F8產(chǎn)酶活力的影響較大。pH為7.0時(shí)，CMC酶活與FPA都達(dá)最高值，分別為0.0254 U/mL和0.0183 U/mL。因此，選擇pH 7.0為最佳發(fā)酵初始pH。

2.7 最佳溫度的確定

按6%的接種量，將種子培養(yǎng)液接種于初始pH 7.0的60 mL產(chǎn)酶發(fā)酵液中，分別放入25，28，32，36，40℃的搖床中，150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)2 d，使菌株發(fā)酵產(chǎn)酶，測(cè)定各pH時(shí)粗酶液的CMC酶活與FPA，結(jié)果如圖5所示。

圖5 溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響

由圖5可知，培養(yǎng)溫度對(duì)F8產(chǎn)纖維素酶影響較大。隨著溫度的上升，發(fā)酵液中酶活力也隨之增加，在發(fā)酵培養(yǎng)溫度為36℃時(shí)，菌株產(chǎn)CMC酶活與FPA均為最大值，分別是0.0213 U/mL和0.0224 U/mL，此后溫度繼續(xù)升高，酶活力反而下降。因此，36℃是發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的最佳培養(yǎng)溫度。

2.8 最佳時(shí)間的確定

按6%的接種量，將種子培養(yǎng)液接種于初始pH 7.0的60 mL產(chǎn)酶發(fā)酵液中，放入36℃的搖床中，150 r/min條件下分別培養(yǎng)1～5 d，使菌株發(fā)酵產(chǎn)酶，分別測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間粗酶液的CMC酶活與FPA，結(jié)果如圖6所示。

圖6 時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響

由圖6可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)8菌株產(chǎn)酶活力也隨之增大，并在2 d處CMC酶活與FPA都取得最高值，分別為0.0186 U/mL和0.0229 U/mL。因此，最佳時(shí)間確定為2 d。

2.9 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為研究篩選菌株F8產(chǎn)纖維素酶的最佳培養(yǎng)條件，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)驗(yàn)證各影響因素，對(duì)各個(gè)培養(yǎng)條件進(jìn)行綜合分析和優(yōu)化。根據(jù)上述單因素的試驗(yàn)結(jié)果，選擇七因子三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

由表2進(jìn)行直觀分析，可以看出，CMC酶活的最優(yōu)組合是A2B3C1D2E1F3G1，比較各因素的極差大小為RB=RG>RA=RE>RC>RD=RF，對(duì)CMC酶活影響的主次順序?yàn)锽GAECDF；FPA的最優(yōu)組合是A1B2C1D2E2F2G2，比較各因素的極差大小為RD>RA=RF=RG>RC=RE>RB，對(duì)FPA影響的主次順序?yàn)镈AFGCEB。由于兩個(gè)指標(biāo)單獨(dú)分析出來(lái)的最優(yōu)條件不一致，需要根據(jù)因素對(duì)兩個(gè)指標(biāo)影響的主次順序綜合考慮確定出最優(yōu)組合。

綜合直觀分析，本試驗(yàn)的最優(yōu)組合是A1B3C1D2E1F2G1。碳源CMC-Na濃度是0.5%，氮源濃度1.5%，裝液量40 mL，pH7.0，接種量5%，溫度35 ℃，時(shí)間2 d。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表2

3 結(jié)論

從黑胸散白蟻腸道內(nèi)篩選出來(lái)的一株產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌F8，對(duì)其產(chǎn)酶發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。該菌株產(chǎn)纖維素酶的最佳條件為：羧甲基纖維素鈉質(zhì)量百分比為0.5%，氮源質(zhì)量百分比為 1.5%，裝液量40 mL/300mL，初始pH 7.0，接種量5%，溫度35 ℃，時(shí)間2 d。