杜國軍，張以超，彭凱，田英華，劉祥，王松

(1.齊齊哈爾大學(xué)，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省 普通高校重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

果膠酶是廣泛存在于動植物及微生物中的能分解果膠質(zhì)的一種復(fù)合酶[1]。它主要應(yīng)用于環(huán)境保護、飼料與食品加工、植物抗病害、紡織行業(yè)、造紙洗滌等方面。來源于動植物的果膠酶提取難、產(chǎn)量低，而微生物則生長條件簡單、成長快速、果膠酶產(chǎn)量大。因此，微生物是獲取果膠酶的主要來源方式[2,3]。自然界中真菌、放線菌、細菌等都能夠用來生產(chǎn)果膠酶。其中，黑曲霉是國際上公認的安全微生物菌株[4]。天然黑曲霉的果膠酶產(chǎn)量較低，通過簡單有效的微生物誘變菌種，可以大幅提高黑曲霉的產(chǎn)酶能力[5]。微波作為物理誘變劑，具有易于操作、設(shè)備簡單、高效安全等特點，化學(xué)誘變劑亞硝基乙基脲具有誘變用時短、劑量小、效果佳等優(yōu)點，故本研究以微波及亞硝基乙基脲為誘變劑對黑曲霉進行復(fù)合誘變處理，采用透明圈法與固態(tài)發(fā)酵法選育出高產(chǎn)果膠酶性能穩(wěn)定的黑曲霉突變菌株，以期為果膠酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉ZYC-06：齊齊哈爾大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點實驗室；果膠：生工生物工程(上海)股份有限公司；PB-10酸度計：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；微波爐：廣東格蘭仕集團有限公司；隔水培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)

200 g去皮馬鈴薯，切塊煮沸30 min，破碎，紗布過濾，加20 g瓊脂及葡萄糖，補足蒸餾水至1000 mL，pH值自然。

1.2.2 果膠培養(yǎng)基

2.0 g瓊脂，0.2 g果膠，0.1 g磷酸氫二鉀，0.05 g硫酸鎂，0.3 g硝酸鈉，0.001 g硫酸鐵，pH值5.5。

1.2.3 固體發(fā)酵培養(yǎng)基

0.25 g豆粕，10 g麩皮，0.1 g 硫酸銨，0.35 g硝酸鈉，250 mL錐形瓶，按料液比1∶1.5加入pH調(diào)至5.5的蒸餾水。

1.3 實驗方法

1.3.1 黑曲霉出發(fā)菌株初篩

取1支活化好的黑曲霉ZYC-06斜面菌株，用無菌生理鹽水洗下孢子，無菌棉過濾后，置于裝有玻璃珠的錐形瓶中，振蕩30 min分散孢子，制成濃度為106個/mL的均勻單孢子懸液。將單孢子懸液稀釋103，104，105，106倍，用移液槍移取100 μL接種在無菌的PDA平皿上，均勻涂布，倒置，30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)5～7 d。用接菌環(huán)將單菌落接種于果膠培養(yǎng)基平皿，向平皿中加入5 mL盧戈氏碘液，靜止2 min后，倒出碘液，加入5 mL生理鹽水，10 min后倒出，觀察是否有透明圈產(chǎn)生及透明圈的大小，選取透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株進行復(fù)篩。

1.3.2 黑曲霉出發(fā)菌株復(fù)篩

將初篩得到的黑曲霉菌株接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基，進行固體發(fā)酵，30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)4～5 d，測其果膠酶活力，選取果膠酶活力較高的作為出發(fā)菌株。

1.3.3 果膠酶活力的測定

采用DNS比色法(3,5-二硝基水楊酸法)測定果膠酶活力[6]。具體方法：繪制D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。取適當(dāng)稀釋的酶液0.5 mL于比色管中，加入2 mL pH 4.0的0.4%果膠溶液。45 ℃條件下恒溫水浴30 min，加入DNS溶液混勻沸水浴5 min，流水冷卻，蒸餾水定容至25 mL，520 nm測定吸光值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算半乳糖醛酸含量。酶活力定義為：在pH值3.0、溫度50 ℃水浴條件下，每分鐘分解果膠生成1 μmol半乳糖醛酸所需果膠酶的量為一個酶活力單位(U)。

1.3.4 黑曲霉的復(fù)合誘變處理

1.3.4.1 微波誘變處理

取1支出發(fā)菌種斜面，活化后，用無菌生理鹽水洗下孢子，經(jīng)過濾、振蕩分散成單孢子懸液，加蒸餾水調(diào)整孢子濃度為106個/mL。用移液管吸取單孢子懸液，轉(zhuǎn)入平皿中，每個平皿的單孢子懸液加入量為10 mL，將盛有單孢子懸液的平皿置于功率700 W、頻率2450 Hz的微波爐中[7,8]，對單孢子懸液進行微波照射處理，時間為0，10，20，30，40，50，60，70，80 s。從平皿中吸取不同照射時間的單孢子懸液，適當(dāng)稀釋后，用移液槍吸取100 μL涂布于PDA平皿，每組實驗做3個平行，30 ℃條件下恒溫避光倒置培養(yǎng)5 d，統(tǒng)計菌落存活數(shù)量，確定最適微波誘變時間。然后按照微波最適誘變時間進行處理，選取高產(chǎn)果膠酶的黑曲霉突變菌株。

1.3.4.2 亞硝基乙基脲誘變處理

取經(jīng)微波處理后透明圈直徑與菌落直徑比值較大的黑曲霉菌株，30 ℃條件恒溫培養(yǎng)5 d，經(jīng)過濾、振蕩分散成單孢子懸液，加蒸餾水調(diào)整孢子濃度為106個/mL。用濃度0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12 mg/mL的亞硝基乙基脲溶液分別對單孢子懸液進行誘變處理，10 min后加入2.0%的硫代硫酸鈉溶液終止誘變。用移液槍吸取100 μL涂布于PDA平皿，每組實驗做3個平行，30 ℃條件下恒溫避光倒置培養(yǎng)5 d，統(tǒng)計菌落存活數(shù)量，確定最適亞硝基乙基脲誘變濃度。然后按照亞硝基乙基脲最適誘變條件進行處理，選取高產(chǎn)果膠酶的黑曲霉突變菌株。

1.3.4.3 繪制黑曲霉致死率曲線

按照公式致死率(%)=(未處理存活孢子數(shù)-處理存活孢子數(shù))/未處理存活孢子數(shù)，計算出黑曲霉菌株的致死率，以誘變時間為橫坐標(biāo)，致死率為縱坐標(biāo)，繪制出黑曲霉的致死率曲線。選擇致死率在70%～80%范圍內(nèi)的處理條件作為微波及亞硝基乙基脲的最適誘變條件。

1.3.5 黑曲霉突變菌株初篩

方法同1.3.1。

1.3.6 黑曲霉突變菌株復(fù)篩

將初篩獲得的黑曲霉突變菌株接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)4～5 d，每個培養(yǎng)基中加入25倍的蒸餾水，浸泡3 h，紗布過濾，得到黑曲霉發(fā)酵粗酶液。粗酶液加蒸餾水稀釋1000倍，采用DNS法測定其果膠酶活力，選擇果膠酶活力較高的突變株連續(xù)傳5代，測其穩(wěn)定性，最終獲取正突變菌株中性能穩(wěn)定且果膠酶活力高的黑曲霉突變菌株。

2 結(jié)果與討論

2.1 微波誘變時間的確定

黑曲霉出發(fā)菌株ZYC-06經(jīng)微波照射，得到不同照射時間的致死率，繪制出致死率曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 黑曲霉出發(fā)菌株ZYC-06微波誘變致死率Fig.1 The lethallty rate of Aspergillus niger original strain ZYC-06 by microwave mutation

由圖1可知，隨著微波照射時間的延長，黑曲霉的致死率也明顯增加。當(dāng)照射時間為40 s時致死率為77%，80 s時黑曲霉菌株全部死亡，致死率達到100%。因此，黑曲霉ZYC-06的最適微波誘變時間確定為40 s。

2.2 微波誘變結(jié)果

將盛有黑曲霉ZYC-06單孢子懸液的平皿置于微波爐中誘變40 s后，果膠培養(yǎng)基涂布，30 ℃條件下培養(yǎng)5 d，采用透明圈法及固體發(fā)酵培養(yǎng)篩選出10株產(chǎn)果膠酶活力明顯大于出發(fā)菌株的突變菌株，結(jié)果見表1。

表1 微波誘變結(jié)果Table 1 The results of microwave mutation

其中，黑曲霉ZYC-A05產(chǎn)果膠酶活力最高，達到了1469 U/g，透明圈圖片見圖2。

圖2 黑曲霉突變株ZYC-A05Fig.2 Aspergillus niger original strain ZYC-A05

2.3 亞硝基乙基脲誘變濃度的確定

利用不同濃度的亞硝基乙基脲溶液對黑曲霉突變株ZYC-A05進行化學(xué)誘變處理，得到致死率曲線，結(jié)果見圖3。

圖3 黑曲霉突變株ZYC-A05亞硝基乙基脲致死率Fig.3 The lethallty rate of Aspergillus niger original strain ZYC-A05 by nitrosoethylurea

由圖3可知，隨著亞硝基乙基脲溶液濃度的增加，黑曲霉ZYC-A05的致死率也不斷增加，在0.06 mg/mL時，致死率在70%～80%之間，故黑曲霉ZYC-A05的亞硝基乙基脲最適處理濃度為0.06 mg/mL。

2.4 亞硝基乙基脲誘變結(jié)果

使用濃度為0.06 mg/mL亞硝基乙基脲對黑曲霉ZYC-A05誘變處理10 min，終止后，涂布單孢子懸液于果膠培養(yǎng)基，30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)5 d，采用透明圈法及固體發(fā)酵培養(yǎng)篩選出6株產(chǎn)果膠酶活力明顯大于出發(fā)菌株的突變菌株，結(jié)果見表2。

表2 亞硝基乙基脲誘變結(jié)果Table 2 The mutation results of nitrosoethylurea

其中，黑曲霉ZYC-B03產(chǎn)果膠酶活力最高，達到了2790 U/g，透明圈圖片見圖4。

圖4 黑曲霉突變株ZYC-B03 Fig.4 Aspergillus niger mutant strain ZYC-B03

2.5 突變株產(chǎn)果膠酶穩(wěn)定性

選取產(chǎn)果膠酶活力最大的黑曲酶突變株ZYC-B03進一步傳代培養(yǎng)，連續(xù)傳代5次，對其遺傳穩(wěn)定性進行檢驗，結(jié)果見表3。

表3 黑曲酶突變株ZYC-B03的傳代培養(yǎng)情況Table 3 The passage culture situation of Aspergillus niger mutant strain ZYC-B03

由表3可知，突變株ZYC-B03在傳代5次后，產(chǎn)果膠酶性能穩(wěn)定且活力較高，平均產(chǎn)果膠酶活力2780 U/g。因此，黑曲霉ZYC-B03是一株可以用來研究果膠酶的優(yōu)良實驗菌種。

3 結(jié)論

本研究采用微波及亞硝基乙基脲為誘變劑，對黑曲霉ZYC-06進行誘變處理。結(jié)果表明：微波照射40 s，0.06 mg/mL亞硝基乙基脲處理10 min為最適誘變劑量，誘變后獲得1株遺傳性能穩(wěn)定的黑曲霉突變株ZYC-B03，該突變株在30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)5d，產(chǎn)果膠酶活力達到了2790U/g，是出發(fā)菌株的2.88倍。