方秋野，王毛毛，劉瑤，王如福

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801)

薏苡(Coixlacryma-jobiL.)屬禾本科一年或多年生草本植物，其干燥成熟的種仁被稱為薏仁，又名薏米等[1]。薏仁在我國(guó)各地及亞洲其他國(guó)家均有分布，我國(guó)主產(chǎn)區(qū)為福建、貴州、江蘇、河北、遼寧等地[2]。其中，貴州省的薏仁資源較為豐富，是我國(guó)重要的薏仁生長(zhǎng)區(qū)[3]。作為我國(guó)首批公布的藥食同源食品之一，薏仁的營(yíng)養(yǎng)及藥用價(jià)值極高。著名醫(yī)藥典籍《本草綱目》就曾指出薏仁有“健脾益胃，補(bǔ)肺清熱，強(qiáng)筋健骨”之功效[4]。薏仁富含蛋白質(zhì)、氨基酸、淀粉、維生素、礦物質(zhì)、脂肪和水溶性纖維等營(yíng)養(yǎng)成分，以及薏仁內(nèi)酯、黃酮和三萜類化合物和多糖等功能成分，臨床藥理研究表明，薏仁具有抗炎、抗腫瘤、降血糖、免疫調(diào)節(jié)及抑制骨質(zhì)疏松等多種藥理活性[5]。

國(guó)內(nèi)外對(duì)于薏仁的研究主要集中在薏仁多糖等功能成分的提取及提取工藝優(yōu)化等方面[6-9]。長(zhǎng)期以來(lái)，薏仁的食用方法都以直接蒸煮為主，市面上缺少其深加工制品，加之其本身風(fēng)味不能被大眾完全接受，導(dǎo)致薏仁這一高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值谷物的流通和消費(fèi)受到了極大限制。如今隨著科技的飛速發(fā)展，對(duì)薏仁加工食品的研究與開發(fā)日益增加，魏建春等[10]以薏仁、紅棗為主料,優(yōu)化浸提制汁工藝,研制出了一款口感優(yōu)良、營(yíng)養(yǎng)豐富的功能型保健飲料，呂峰等[11]通過(guò)均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出最佳的薏仁酒釀造工藝條件等，但針對(duì)薏仁發(fā)酵前的液化及糖化工藝研究較少。薏仁中含有較多的活性功能成分，若在其發(fā)酵產(chǎn)品中能最大程度地保留這些物質(zhì)，將更有利于實(shí)現(xiàn)最終產(chǎn)品的功能化。而液化及糖化是薏仁發(fā)酵前的重要環(huán)節(jié)，同時(shí)也是功能成分較易損失的環(huán)節(jié)，在該階段的研究中應(yīng)保證薏仁糖化醪具有較好的發(fā)酵性能并且保留更多功能成分，這對(duì)薏仁發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的提高具有重要的意義。

薏仁直鏈淀粉含量高，用其作為釀醋不易進(jìn)行糖化，并使得淀粉利用率低，用薏仁為單一原料進(jìn)行釀造使得產(chǎn)品口感寡淡，品質(zhì)不佳。高粱中含有較高淀粉、較低脂肪和適量的蛋白質(zhì)，是一種很好的釀醋原料[12]。同時(shí)，高粱所含支鏈淀粉含量較高，可促使薏仁較快地進(jìn)行液化及糖化反應(yīng)，并提高產(chǎn)酒率，而且酒液中殘留的低聚糖和極限糊精較多，口感醇厚[13]。故本試驗(yàn)選擇添加一定量的高粱，在降低薏仁醋制品成本和提高產(chǎn)品品質(zhì)的同時(shí)，也改善了其風(fēng)味和口感，使其更易于被大眾接受。本試驗(yàn)旨在確定薏仁液化及糖化的最優(yōu)工藝，為薏仁醋釀造中的液化及糖化工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

薏仁:產(chǎn)自貴州黔西南州；α-淀粉酶(40000 U/g)、糖化酶(100000 U/g)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)備

DS-1型組織搗碎機(jī) 上海昂尼儀器儀表有限公司；THZ-82恒溫振蕩水浴鍋 常州潤(rùn)華電器有限公司；BS210S電子天平 德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；722可見分光光度計(jì) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；DZTW電子調(diào)溫電熱套 天津工興實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

薏仁→挑選→清洗→粉碎→糊化→加入耐高溫α-淀粉酶→加熱滅酶→加入糖化酶→加熱滅酶→薏仁糖化醪。

1.2.2 薏仁液化及糖化單因素試驗(yàn)

以還原糖和總黃酮含量為指標(biāo)，在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)置高粱添加量(0.6，0.7，0.8，0.9，1.0倍)、料水比例(1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6)、α-淀粉酶添加量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)、液化溫度(70，75，80，85，90 ℃)、液化時(shí)間(20，30，40，50，60 min)、糖化酶添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)、糖化溫度(50，55，60，65，70 ℃)、糖化時(shí)間(20，30，40，50，60 min)8個(gè)單因素試驗(yàn)，考察其對(duì)糖化終點(diǎn)還原糖及總黃酮含量的影響。

1.2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果確定各因素的范圍，以薏仁糖化醪還原糖含量為響應(yīng)值，使用Design-Expert 10軟件創(chuàng)建Plackett-Burman試驗(yàn)，對(duì)高粱添加量(A)、料水比例(B)、α-淀粉酶添加量(C)、液化溫度(D)、液化時(shí)間(E)、糖化酶添加量(F)、糖化溫度(G)、糖化時(shí)間(H)8 個(gè)變量進(jìn)行篩選，另設(shè)置3個(gè)虛擬變量來(lái)衡量試驗(yàn)誤差，通過(guò)軟件分析篩選出對(duì)薏仁糖化醪有顯著影響的因素。

1.2.4 最陡爬坡試驗(yàn)

基于Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出的顯著影響因素，以糖化醪還原糖含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)爬坡方向并確定合適的步長(zhǎng)，以求高效地逼近各因素的最佳取值范圍。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于Plackett-Burman試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)，依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取液化溫度、液化時(shí)間、糖化酶添加量3個(gè)影響顯著的因素，以薏仁糖化醪還原糖含量和總黃酮含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的試驗(yàn)，見表1。

1.2.6 測(cè)定方法

總黃酮含量的測(cè)定：參考GB/T 19777-2013中的《總黃酮的檢測(cè)方法》。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)物，NaNO2-Al(NO3)3比色法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.4305x-0.0127，R2=0.9947，其中，y為吸光值，x為蘆丁質(zhì)量。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

式中：X為樣品中總黃酮(以蘆丁計(jì))的含量，mg/100 g；m1為由工作曲線查出(或用回歸方程計(jì)算)試液中總黃酮(以蘆丁計(jì))的質(zhì)量，mg；m為樣品的質(zhì)量，g。

還原糖的測(cè)定：參考GB/T 19777-2013附錄D《還原糖的檢測(cè)方法》。

1.2.7 感官評(píng)價(jià)

高粱添加量感官評(píng)分表見表2。

表2 高粱添加量感官評(píng)分表Table 2 The sensory scoring table of sorghum additive amount

2 結(jié)果與分析

2.1 薏仁液化及糖化單因素試驗(yàn)

2.1.1 高粱添加量的確定

圖2 高粱添加量對(duì)薏仁糖化醪還原糖及總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of sorghum additive amount on the content of reducing sugar and total flavonoids in coax seed saccharificated mash

由圖2可知，糖化醪的還原糖和總黃酮含量隨著高粱添加量的增加而呈現(xiàn)平緩增長(zhǎng)的趨勢(shì)。高粱經(jīng)液化及糖化后產(chǎn)生的醇厚香氣能克服純薏仁糖化醪香氣單薄的弱點(diǎn)，但過(guò)多的高粱則對(duì)混合糖化醪風(fēng)味產(chǎn)生壓制作用，使得糖化醪香氣單一，高粱氣味突出。

圖3 高粱添加量對(duì)薏仁糖化醪感官評(píng)分的影響Fig.3 Effect of sorghum additive amount on sensory score of coax seed saccharificated mash

由圖3可知，高粱添加量為0.8倍時(shí)，薏仁糖化醪有較好的感官評(píng)分?；谝陨暇C合考慮，選擇高粱添加量0.8倍為宜。

2.1.2 料水比的確定

圖4 料水比對(duì)薏仁糖化醪還原糖及總黃酮含量的影響Fig.4 Effect of material-water ratio on the content of reducing sugar and total flavonoids in coax seed saccharificated mash

由圖4可知，隨著水分添加比例的增大，糖化醪還原糖和總黃酮含量呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢(shì)，在料水比為1∶3時(shí)取最大值。水分過(guò)少，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)糖化醪黏稠，液化困難，還原糖和總黃酮溶出較少，且在生產(chǎn)上也不利于料液的降溫和輸送[14]。而加水量過(guò)多則會(huì)導(dǎo)致糖化醪中還原糖和總黃酮濃度較低，不利于后續(xù)發(fā)酵。故選擇料水比為1∶3為宜。

2.1.3 耐高溫α-淀粉酶添加量的確定

圖5 淀粉酶添加量對(duì)薏仁糖化醪還原糖及總黃酮含量的影響Fig.5 Effect of α-amylase additive amount on the content of reducing sugar and total flavonoids in coax seed saccharificated mash

由圖5可知，隨著淀粉酶添加量的逐漸增多，薏仁糖化醪的還原糖和總黃酮含量迅速增加;但淀粉酶添加量大于0.3%時(shí)，還原糖和總黃酮含量基本趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)榈矸勖柑砑恿啃∮?.3%時(shí)，淀粉酶質(zhì)量濃度小于底物質(zhì)量濃度，糖化反應(yīng)速率受酶質(zhì)量影響較大，還原糖和總黃酮含量隨著酶量的增大而增加；酶添加量大于0.3%時(shí)，隨著酶的質(zhì)量濃度的增加，使得一部分的酶無(wú)法與底物接觸，從而導(dǎo)致糖化醪還原糖和總黃酮含量基本不再變化?？紤]成本因素，選擇淀粉酶添加量0.3%為宜。

2.1.4 液化溫度的確定

由圖6可知，淀粉酶對(duì)溫度較為敏感，耐高溫α-淀粉酶的最適反應(yīng)溫度為80～90 ℃，低于最適溫度酶的活力低，不利于其發(fā)揮作用，而溫度過(guò)高又會(huì)抑制酶活[15]，溫度的變化同時(shí)也影響著反應(yīng)速率；薏仁糖化醪還原糖含量受酶活力影響在85 ℃時(shí)達(dá)到最大值，總黃酮在液化溫度的變化過(guò)程中，受淀粉酶活力及氧化溫度的影響，在80 ℃達(dá)到最大值。故選取液化溫度80～85 ℃進(jìn)行下一步試驗(yàn)為宜。

2.1.5 液化時(shí)間的確定

圖7 液化時(shí)間對(duì)薏仁糖化醪還原糖及總黃酮含量的影響Fig.7 Effect of liquefaction time on the content of reducing sugar and total flavonoids in coax seed saccharificated mash

由圖7可知，液化時(shí)間對(duì)薏仁糖化醪還原糖和總黃酮含量影響均較大，隨著液化時(shí)間的延長(zhǎng)，還原糖和總黃酮呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢(shì)。液化前期底物淀粉濃度較高，此時(shí)α-淀粉酶與底物結(jié)合充分，使淀粉分子的α-1,4糖苷鍵斷裂，形成小分子的葡萄糖等物質(zhì)，還原糖含量迅速升高，黃酮類物質(zhì)也隨著液化時(shí)間的延長(zhǎng)而析出。但較長(zhǎng)時(shí)間的酶解使還原糖和黃酮結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定發(fā)生分解，故選擇液化時(shí)間40～50 min為宜。

2.1.6 糖化酶添加量的確定

圖8 糖化酶添加量對(duì)薏仁糖化醪還原糖及總黃酮含量的影響Fig.8 Effect of saccharifying enzyme additive amount on the content of reducing sugar and total flavonoids in coax seed saccharificated mash

由圖8可知，薏仁糖化醪的還原糖和總黃酮含量隨著糖化酶添加量的增多而增加，當(dāng)糖化酶添加量為2.0%時(shí)，還原糖含量達(dá)到11.8 g/mL，總黃酮含量為123.6 mg/100 g，達(dá)到了較高的飽和范圍，再繼續(xù)添加糖化酶量，還原糖和總黃酮含量雖有上升但變化并不明顯。從經(jīng)濟(jì)成本和糖化程度等因素進(jìn)行綜合考慮，選擇淀粉酶添加量2%為宜。

2.1.7 糖化溫度的確定

圖9 糖化溫度對(duì)薏仁糖化醪還原糖及總黃酮含量的影響Fig.9 Effect of saccharification temperature on the content of reducing sugar and total flavonoids in coax seed saccharificated mash

由圖9可知，糖化溫度對(duì)薏仁糖化醪還原糖及總黃酮含量的影響與液化溫度對(duì)其影響相似，故糖化溫度選擇60 ℃為宜。

2.1.8 糖化時(shí)間的確定

圖10 糖化時(shí)間對(duì)薏仁糖化醪還原糖及總黃酮含量的影響Fig.10 Effect of saccharification time on the content of reducing sugar and total flavonoids in coax seed saccharificated mash

由圖10可知，薏仁糖化醪還原糖和總黃酮含量隨著液化時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢(shì)，其作用機(jī)理可能是糖化時(shí)間較短使糖化不完全，還原糖和總黃酮析出不充分，而較長(zhǎng)時(shí)間的糖化過(guò)程使還原糖和黃酮結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定發(fā)生分解，且在40～50 min階段，糖化時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)于薏仁糖化醪還原糖含量的增長(zhǎng)貢獻(xiàn)不足以彌補(bǔ)對(duì)總黃酮的破壞程度，故綜合考慮選擇糖化時(shí)間40 min為宜。

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

以薏仁糖化醪還原糖含量為響應(yīng)值，進(jìn)行8因素12組試驗(yàn)，每組平行測(cè)定3次，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)因素水平及影響Table 3 Factors and levels of Plackett- Burman experiment

續(xù) 表

注：“*”表示影響顯著(P<0.05)；“**”表示影響極顯著(P<0.01)。表6和表7同。

由表3可知，液化溫度(P=0.0027)、液化時(shí)間(P=0.0072)及糖化酶添加量(P=0.0067)對(duì)糖化醪還原糖含量影響極顯著；回歸方程為：還原糖含量=8.37+0.054A+0.0887B-4.167E-003C+0.43D+0.30E+0.31F+0.13G+0.10H，模型R2=0.9846，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故Plackett-Burman試驗(yàn)篩選的重要影響因素為液化溫度、液化時(shí)間和糖化酶添加量，對(duì)這3個(gè)因素進(jìn)行下一步的優(yōu)化，其余影響不顯著的因素則根據(jù)單因素優(yōu)化結(jié)果取值。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

基于Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，選取液化溫度、液化時(shí)間和糖化酶添加量3個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 The steepest ascent experimental design and results

由表4可知，第4組試驗(yàn)得到的還原糖含量最高，故3個(gè)因素的中心點(diǎn)分別取為：液化溫度85 ℃，液化時(shí)間50 min，糖化酶添加量2.0%。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

以薏仁糖化醪還原糖含量和總黃酮含量為響應(yīng)值，采用Design-Expert 10軟件提供的Box-Behnken試驗(yàn)和響應(yīng)面分析[16]，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Box-Behnken experimental design and results

續(xù) 表

2.4.2 模型的建立與方差分析

運(yùn)用Design-Expert 10數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)表5中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，經(jīng)二次多元回歸擬合，結(jié)果見表6和表7。

表6 還原糖含量的方差分析Table 6 Analysis of variance of reducing sugar

表7 總黃酮含量的方差分析Table 7 Analysis of variance of total flavonoids

方差分析結(jié)果顯示：2 個(gè)模型的P值均小于0.0001，且失擬項(xiàng)P 值均大于0.05，故2個(gè)模型均為回歸顯著型。R12(還原糖含量)=0.9925，R22(總黃酮含量)=0.9932，表明預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值之間擬合度較高。各因素對(duì)薏仁糖化醪還原糖含量的影響大小為：液化溫度(A)>液化時(shí)間(B)>糖化酶添加量(C)，各因素對(duì)薏仁糖化醪總黃酮含量的影響大小為：糖化酶添加量(C)>液化溫度(A)>液化時(shí)間(B)。經(jīng)過(guò)回歸擬合，分別得到Y(jié)1(還原糖含量)和Y2(總黃酮含量)的二次元回歸方程：

Y1=13.26-1.26A-1.18B+0.47C+1.04AB-1.10AC+1.21BC-1.41A2-0.39B2-1.80C2，Y2=132.87-7.39A+0.077B-7.91C+5.63AB-2.44AC-0.75BC-4.53A2-19.96B2-2.29C2。

2.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析

運(yùn)用Design-Expert 10軟件對(duì)表5中數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，繪制出3個(gè)因素之間的交互作用對(duì)薏仁糖化醪還原糖及總黃酮含量的影響，見圖11。

圖11 各因素交互作用對(duì)薏仁糖化醪還原糖和 總黃酮含量影響的響應(yīng)面圖

由圖11中a～c可知，液化溫度、液化時(shí)間和糖化酶添加量?jī)蓛山换ロ?xiàng)均對(duì)薏仁糖化醪的還原糖含量產(chǎn)生了顯著的影響。由圖11中 a和b可知，當(dāng)液化時(shí)間和糖化酶添加量一定時(shí)，隨著液化溫度的升高，糖化醪還原糖含量先增大，達(dá)到極大值后開始下降。這是因?yàn)橐夯瘻囟冗^(guò)高，導(dǎo)致還原糖受熱不穩(wěn)定發(fā)生分解，而溫度過(guò)低，則使液化不充分，從而還原糖析出不充分。由圖11中a和c可知，當(dāng)液化溫度和糖化酶添加量一定時(shí)，隨著液化時(shí)間的延長(zhǎng)，糖化醪的還原糖含量先增大后減少。這是因?yàn)橐夯瘯r(shí)間過(guò)短使得液化不充分，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則破壞還原糖的穩(wěn)定性使其分解從而減少。由圖11中b和c可知，當(dāng)液化溫度和液化時(shí)間一定時(shí)，隨著糖化酶添加量的增加，還原糖含量同樣呈現(xiàn)出先增大后減少的變化。

由圖11中d～f可知，液化溫度與液化時(shí)間的交互作用、液化溫度與糖化酶添加量的交互作用均對(duì)薏仁糖化醪總黃酮含量影響顯著，液化時(shí)間與糖化酶添加量的交互作用對(duì)總黃酮含量影響不顯著。這與方差分析結(jié)果一致。

由回歸方程擬合得到的薏仁糖化液化及糖化的最優(yōu)工藝條件為：液化溫度81.57 ℃，液化時(shí)間47.65 min，糖化酶添加量1.8915%。在此優(yōu)化條件下薏仁糖化醪的還原糖理論值為13.595 g/dL，總黃酮含量理論值為136.795 mg/100 g。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，將以上最優(yōu)工藝條件調(diào)整為：液化溫度81.5 ℃，液化時(shí)間47 min，糖化酶添加量1.9%。在此條件下重復(fù)3次試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，得到的糖化醪還原糖含量為13.2 g/dL，與預(yù)測(cè)值相比誤差為2.9%；總黃酮含量為136.55 mg/100 g，與預(yù)測(cè)值相比誤差為0.17%，由此可知，利用該模型優(yōu)化所得的條件準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本研究設(shè)置了高粱添加量、料水比、α-淀粉酶添加量、液化溫度、液化時(shí)間、糖化酶添加量、糖化溫度、糖化時(shí)間8個(gè)單因素試驗(yàn)，考察其對(duì)糖化醪還原糖及總黃酮含量的影響。在單因素的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman試驗(yàn)，快速有效地篩選出顯著影響薏仁糖化醪還原糖和總黃酮含量的3個(gè)主要因素分別為液化溫度、液化時(shí)間和糖化酶添加量。通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析確定了薏仁糖化最優(yōu)工藝條件為：高粱添加量0.8倍，料水比1∶3，α-淀粉酶添加量0.3%，液化溫度81.5 ℃，液化時(shí)間47 min，糖化酶添加量1.9%，糖化溫度60 ℃，糖化時(shí)間40 min。在此條件下得到的薏仁糖化醪還原糖含量可達(dá)13.2 g/dL，總黃酮含量可達(dá)136.55 mg/100 g。