田濤,傅強(qiáng),朱健奎,尹宏

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)揚(yáng)州附屬醫(yī)院，江蘇 揚(yáng)州 225000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院，江蘇 南京 210001)

骨質(zhì)疏松是一種以全身性骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征的代謝性疾病，患者骨骼脆性增加，骨折風(fēng)險較正常人顯著提高[1]。目前普遍認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥主要病理機(jī)制是破骨細(xì)胞活性增高，骨吸收亢進(jìn)，骨形成與骨吸收平衡被打破，進(jìn)而引起骨骼病變[2]。骨質(zhì)疏松癥可分為原發(fā)性骨質(zhì)疏松和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松。原發(fā)性骨質(zhì)疏松包括絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松和老年性骨質(zhì)疏松，多由雌激素減少和老齡化引起。繼發(fā)性骨質(zhì)疏松一般具有明確的病原學(xué)機(jī)制，如糖皮質(zhì)激素過量或甲亢等[3]。目前臨床上多用鈣劑、骨質(zhì)吸收抑制劑和雌激素等對骨質(zhì)疏松進(jìn)行治療，但均有不同程度的副作用[4-6]。

骨質(zhì)疏松屬中醫(yī)學(xué)“骨痿”的范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎主骨，腎虛髓虧、骨髓生化乏源，故骨脆易折。臨床上常用補(bǔ)腎填精的方藥治療。二至丸首見于明代吳旻輯《扶壽精方》，由女貞子與墨旱蓮二藥組成，具有滋補(bǔ)肝腎、強(qiáng)壯腰膝的作用[7]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其主要成分為三萜類、環(huán)烯醚萜類、黃酮類、苯醇類、木脂素類、芳雜環(huán)類、生物堿類、甾醇等[8]，臨床報(bào)道顯示二至丸具有改善骨質(zhì)疏松癥的作用，然而其作用的主要機(jī)制尚未明確[9]。本研究擬通過建立斑馬魚骨質(zhì)疏松模型，觀察二至丸對斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的影響，并探索二至丸改善骨質(zhì)疏松的潛在機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 潑尼松龍(Prednisolone,Pred)(上海源葉生物有限公司，批號：T20J7H9291)，依替膦酸二鈉(ED)，鈣黃綠素(上海源葉生物有限公司，批號：K22A8M34493，S19167)，三卡因(SIGMA-ALDRICH中國，批號：MKBV1603V)，墨旱蓮、女貞子均來源于江蘇省中醫(yī)院制劑室并經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉圣金副教授鑒定。墨旱蓮組：墨旱蓮(6 g)，女貞子組：女貞子(6 g)，二至丸組：墨旱蓮(6 g)+女貞子(6 g)。分別稱取上述藥材各5倍處方量，經(jīng)粉碎至40目，5倍量水回流提取2 h，再4倍量水回流提取1.5 h，合并2次提取液，減壓濃縮，制備成墨旱蓮及女貞子單藥生藥量1 g/mL，二至丸復(fù)方1 g/mL。4 ℃冷藏備用。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme，批號：R223-01-AB,R223-01-AC)，擴(kuò)增試劑盒(Vazyme，批號：MIX:Q111-02-AA)，無酶水(Vazyme，批號：R223-01-AA)。DMEM培養(yǎng)基(GIBCO，貨號：12800017)。脂多糖(Sigma-aldrich，貨號：L-2630)。TRAP染色試劑盒(Sigma-aldrich，貨號：387A-1KT)PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成。引物序列見表1。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物及細(xì)胞 受精后1 d(1 dpf)的AB品系斑馬魚，購于南京一樹梨花生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵守《實(shí)驗(yàn)動物管理與使用指南》。斑馬魚飼養(yǎng)條件為晝夜節(jié)律為晝∶夜=14 h∶10 h；溫度為(28.5±0.5)℃。購回后適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d，即得3 dpf斑馬魚。小鼠前破骨細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 體式熒光顯微鏡(德國Leica公司，型號：M205FA)；高通量多樣品組織研磨儀(南京喬貝琳生物科技有限公司，型號：Tissuelyser-48)；酶標(biāo)儀(Biotek，型號：Synergy2)，實(shí)時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，型號：7500)；定量病理成像分析系統(tǒng)(PerkinElmer，型號：5417R)。

1.2 方法

1.2.1 斑馬魚藥物濃度篩選 隨機(jī)選取3 dpf正常斑馬魚置于六孔板中，每孔(組)20尾，分別給予墨旱蓮(50、100、200 μg/mL)，女貞子(50、100、200 μg/mL)，二至丸(100、200、400 μg/mL)，每孔給予3 mL培養(yǎng)基，同時設(shè)置空白對照組、潑尼松龍(25 μmol/L)模型藥組及依替磷酸二鈉(300 mg/L)陽性藥組。28 ℃生化培養(yǎng)箱晝夜孵育持續(xù)9 d。記錄每日斑馬魚死亡數(shù)量，統(tǒng)計(jì)每組總體死亡率，確定墨旱蓮、女貞子及二至丸對斑馬魚的最適濃度。

表1 引物序列

1.2.2 斑馬魚骨質(zhì)疏松模型治療效果評價 選取健康的3 dpf的斑馬魚隨機(jī)分為5組，置于6孔板中，每孔3 mL培養(yǎng)基，分組及給藥如下：Control組、Model組(25 μmol/L Pred)、ED組(300 mg/L)、墨旱蓮組、女貞子組和二至丸組。從3 dpf開始，Control組加入含0.1%DMSO的培養(yǎng)基，其余各組加入含25 μmol/L Pred培養(yǎng)基(含0.1% DMSO)。從5 dpf開始給藥，Control組、Model組及ED組條件不變，墨旱蓮組給予含25 μmol/L Pred和50 μg/mL墨旱蓮含藥培養(yǎng)基，女貞子組給予含25 μmol/L Pred和50 μg/mL女貞子含藥培養(yǎng)基，二至丸組給予含25 μmol/L Pred和100 μg/mL二至丸含藥培養(yǎng)基，所有組別均含0.1% DMSO。連續(xù)給藥4 d，于第9 dpf取20尾形態(tài)正常斑馬魚進(jìn)行鈣黃綠素染色拍照，而后使用Image J 19統(tǒng)計(jì)每尾斑馬魚幼魚頭骨及椎骨熒光面積；另取20尾提取RNA并完成相關(guān)基因檢測。

1.2.3 MTT比色法檢測RAW264.7細(xì)胞活力 取生長良好的RAW264.7細(xì)胞于種板后24 h按藥物比例分組并給藥：空白組、墨旱蓮組(1、10、50、100、200、400、600、800、1 000 mg/L)、女貞子組(1、10、50、100、200、400、600、800、1 000 mg/L)及二至丸組(1、10、50、100、200、400、600、800、1 000 mg/L)，每組重復(fù)6個復(fù)孔，于給藥后48 h采用MTT法檢測細(xì)胞活力。

1.2.4 qPCR檢測各基因表達(dá) 斑馬魚幼魚于第9 dpf用Trizol裂解液提取其RNA，并測定RNA濃度；RAW264.7細(xì)胞分組及給藥方式同前，干預(yù)4 d后提取各組RNA并測定RNA濃度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：RNA+RNase-Free Water=12 μL，4×gDNA 4 μL/管，42 ℃反應(yīng)2 min，50 ℃反應(yīng)30 s；5×HiscriptⅡ 4 μL 50 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s?？傮w積20 μL，-20 ℃保存。引物序列：由金斯瑞生物科技公司(南京)設(shè)計(jì)并合成。檢測指標(biāo)包括Runx2，Bmp-2b，ALP，TRAP，CTSK，NFATC-1，ATG5，p62，mTOR,TRAP及Beclin：擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：2×Ace qPCR SYBR Green Master Mix 10.0 μL，50×ROX Reference Dye 2 0.4 μL，F(xiàn)orward Primer(10 μL)0.8 μL，Reverse Primer(10 μmol/L)0.8 μL，ddH2O 6 μL，cDNA 2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，進(jìn)行40個循環(huán)；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，95 ℃再變性15 s以繪制融解曲線，計(jì)算各基因相對表達(dá)水平并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 藥物安全性評價

通過加入不同濃度的藥物觀察并統(tǒng)計(jì)藥物不同濃度對斑馬魚生長發(fā)育的影響。結(jié)果顯示，墨旱蓮在200 μg/mL濃度下斑馬魚死亡尾數(shù)較多，而在50 μg/mL濃度下死亡尾數(shù)最少；女貞子在100 μg/mL與200 μg/mL濃度下死亡尾數(shù)較多，在50 μg/mL濃度下死亡尾數(shù)最少；二至丸在400 μg/mL濃度下死亡尾數(shù)較多，在100 μg/mL濃度下死亡尾數(shù)最少。根據(jù)二至丸藥物構(gòu)成比例(墨旱蓮∶女貞子=1∶1)，故選擇墨旱蓮(50 μg/mL)，女貞子(50 μg/mL)，二至丸(100 μg/mL)為斑馬魚正常生長發(fā)育的最適濃度。見圖1。

2.2 二至丸抗骨質(zhì)疏松活性評價

通過持續(xù)4 d給予骨質(zhì)疏松模型斑馬魚最適濃度的墨旱蓮、女貞子及二至丸后，觀察并評價3組方藥抗骨質(zhì)疏松活性。研究發(fā)現(xiàn)，鈣黃綠素對骨中鈣離子敏感性較強(qiáng)，且其無毒性也更加適合觀察斑馬魚骨骼的發(fā)育[10]。本研究通過鈣綠素染色統(tǒng)計(jì)斑馬魚頭骨與椎骨熒光面積發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，模型組骨骼熒光面積均顯著減少，提示斑馬魚骨質(zhì)疏松模型構(gòu)建良好。與模型組比較，陽性藥組、女貞子組及二至丸組骨骼熒光面積均顯著增加，且二至丸組骨骼增加面積顯著高于墨旱蓮組，但與女貞子組無明顯差異。表明二至丸可以有效改善斑馬魚骨質(zhì)疏松癥。見圖2。

2.3 二至丸方對成骨及破骨相關(guān)基因表達(dá)的影響

qPCR法檢測各組斑馬魚給藥后成骨及破骨相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組成骨標(biāo)志基因堿性磷酸酶(ALP)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(Bmp-2b)和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)表達(dá)均顯著降低，破骨標(biāo)志基因組織蛋白酶K(CTSK)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和活化T細(xì)胞核因子(NFATC-1)表達(dá)顯著升高。與模型組比較，ED組、墨旱蓮組、女貞子及二至丸組成骨標(biāo)志基因表達(dá)顯著升高，二至丸組破骨標(biāo)志基因顯著降低，且相較于墨旱蓮組及女貞子組，二至丸組更加促進(jìn)了Runx2基因表達(dá)，降低了CTSK、TRAP及NFATC-1基因表達(dá)。提示相較于墨旱蓮與女貞子，二至丸更加有效的增加了骨質(zhì)疏松斑馬魚成骨標(biāo)志基因表達(dá)，降低了破骨相關(guān)基因表達(dá)。見圖3。

2.4 二至丸對RAW264.7細(xì)胞增殖的影響

藥物干預(yù)24 h后MTT法檢測各組細(xì)胞活力。與空白組相比，RAW264.7細(xì)胞在墨旱蓮組200 μg/mL及更高濃度下細(xì)胞活力顯著下降；在女貞子組1 000 μg/mL及更高濃度下細(xì)胞活力顯著提高；不同藥物濃度對二至丸組細(xì)胞活力影響不明顯。與模型組相比，在墨旱蓮組50 μg/mL濃度下細(xì)胞活力未見明顯差異，故選取墨旱蓮50 μg/mL作為參照。根據(jù)二至丸藥物構(gòu)成比例，選擇墨旱蓮50 μg/mL，女貞子50 μg/mL，二至丸100 μg/mL為對RAW264.7細(xì)胞活力無明顯影響的最適濃度。見圖4。

2.5 二至丸對RAW264.7破骨分化的影響

與空白組相比，LPS誘導(dǎo)組TRAP染色顏色明顯加深，TRAP陽性細(xì)胞(紫紅色)顯著增加。與模型組相比，墨旱蓮組與女貞子組TRAP陽性細(xì)胞數(shù)量有下降趨勢，二至丸組TRAP陽性細(xì)胞數(shù)量顯著減少。提示二至丸可有效抑制破骨細(xì)胞分化水平。見圖5。

2.6 二至丸對RAW264.7破骨分化標(biāo)志基因表達(dá)的影響

qPCR法檢測各組細(xì)胞經(jīng)藥物干預(yù)后破骨分化基因的表達(dá)。與空白組相比，LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞CTSK、NFATC-1、TRAP表達(dá)顯著升高。與模型組相比，墨旱蓮組、女貞子組與二至丸組CTSK、NFATC-1、TRAP表達(dá)均顯著降低。提示二至丸可通過降低破骨分化標(biāo)志基因從而抑制破骨細(xì)胞分化。見圖6。

2.7 二至丸對自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響

qPCR法檢測各組細(xì)胞經(jīng)藥物干預(yù)后自噬相關(guān)基因的表達(dá)。與對照組相比，LPS誘導(dǎo)組中mTOR、ATG5、Beclin和p62表達(dá)顯著提高。與LPS誘導(dǎo)組相比，墨旱蓮組與二至丸組均顯著抑制mTOR、ATG5、Beclin和p62表達(dá)；女貞子組mTOR、ATG5表達(dá)顯著降低，Beclin、p62表達(dá)明顯降低，且相較于女貞子組，二至丸組更顯著的抑制了p62基因表達(dá)。提示二至丸可通過抑制自噬相關(guān)基因表達(dá)減少破骨細(xì)胞分化，抑制骨吸收，促進(jìn)骨的代謝水平達(dá)到穩(wěn)態(tài)。見圖7。

3 討論

腎為先天之本，主骨，與骨的生長密切相關(guān)。骨質(zhì)疏松屬于祖國醫(yī)學(xué)“骨痿”范疇，歷代醫(yī)家常從滋補(bǔ)肝腎入手治療該病且療效確切。近年關(guān)于二至丸防治骨質(zhì)疏松癥的研究有大量的文獻(xiàn)報(bào)道,并取得了一定的成果。二至丸由女貞子和墨旱蓮2味中藥組成,具有補(bǔ)腎壯骨之功。臨床報(bào)道證實(shí)了二至丸對于骨質(zhì)疏松治療具有明顯的療效[11-12]，但其更深層次的機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步探究。

骨代謝標(biāo)志物可以較直觀的體現(xiàn)骨代謝水平與特征。ALP、Bmp-2b、Runx2、CTSK、TRAP與NFATC-1是骨吸收與骨再生狀態(tài)的骨代謝標(biāo)志物，其中ALP、Bmp-2b、Runx2反應(yīng)成骨細(xì)胞的功能，是評價成骨細(xì)胞活性的關(guān)鍵基因，當(dāng)這些基因表達(dá)增高，成骨細(xì)胞的活動增強(qiáng)，反之則降低。CTSK、TRAP、NFATC-1是體現(xiàn)破骨細(xì)胞活性與骨吸收狀態(tài)的重要指標(biāo)，骨吸收過程中可大量釋放這些基因，當(dāng)破骨細(xì)胞活性下降時則表達(dá)下降。

自噬是細(xì)胞內(nèi)主要的降解系統(tǒng)，細(xì)胞質(zhì)通過該系統(tǒng)被遞送至溶酶體并在溶酶體中降解[13]。自噬作為一種動態(tài)的回收系統(tǒng)，為細(xì)胞更新和體內(nèi)平衡產(chǎn)生新的能量奠定基礎(chǔ)，當(dāng)機(jī)體受到創(chuàng)傷、慢性疾病等應(yīng)激作用時自噬水平會顯著提高?，F(xiàn)有研究表明，以骨量流失為特征的骨質(zhì)疏松等代謝性疾病與自噬作用被抑制密切相關(guān)[14]。在機(jī)體自噬作用過程中，Beclin、p62、mTOR與ATG5發(fā)揮了關(guān)鍵作用。Beclin-1是自噬啟動的必要因素，在自噬過程起修飾作用，自噬選擇底物p62是反映細(xì)胞存活和細(xì)胞凋亡的多功能信號分子[15]。Beclin/P62復(fù)合物是調(diào)控自噬的關(guān)鍵因子之一。目前已知的ATG蛋白共有41種，其中ATG5對于自噬囊泡的形成是必不可少的[16]。ATG5可調(diào)節(jié)肌動蛋白環(huán)來增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性，從而促進(jìn)骨吸收[17]。mTOR是自噬的重要調(diào)節(jié)因子，當(dāng)兩者表達(dá)水平提高時，機(jī)體自噬作用增強(qiáng)，破骨細(xì)胞活性上升并分泌溶酶體與鹽酸定向降解機(jī)體骨骼[18]。種種跡象表明，自噬作用是骨質(zhì)疏松的病理機(jī)制的重要一環(huán)。

本研究驗(yàn)證了墨旱蓮、女貞子與二至丸治療骨質(zhì)疏松的療效。在體實(shí)驗(yàn)表明二至丸、墨旱蓮、女貞子可通過向上調(diào)節(jié)斑馬魚骨質(zhì)疏松模型成骨細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)，促進(jìn)骨形成，增加機(jī)體骨量；同時墨旱蓮和二至丸亦可向下調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)，抑制骨吸收。進(jìn)一步的離體實(shí)驗(yàn)表明自噬作用在破骨細(xì)胞分化過程中明顯增強(qiáng)，而二至丸可顯著降低破骨細(xì)胞自噬相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制破骨細(xì)胞分化成熟并降低骨吸收水平，改善骨質(zhì)疏松的相關(guān)癥狀。本研究通過建立斑馬魚骨質(zhì)疏松模型驗(yàn)證了二至丸的抗骨質(zhì)疏松活性，明確了其通過降低自噬基因表達(dá)水平抑制破骨細(xì)胞分化的作用機(jī)制，其更深層次的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。