鄒小艷，范香成，田友清，尚靖

(1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810007；2.中國科學(xué)院西北高原生物研究所青海省藏藥藥理學(xué)和安全性評(píng)價(jià)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810007；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100190；4.中國藥科大學(xué)天然藥物活性組分與功效國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009；5.中國藥科大學(xué)江蘇省中藥評(píng)價(jià)與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009；6.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇 鹽城 224005)

心肌缺血/再灌注損傷(MIRI)治療的最后壁壘在于，建立心外膜梗死相關(guān)動(dòng)脈通暢性即再灌注的同時(shí)，增加額外的心臟保護(hù)策略以減少梗死面積和冠狀動(dòng)脈微血管功能障礙。盡管抗MIRI新藥研發(fā)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面取得了成功，但將心臟保護(hù)的藥理研究結(jié)果轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐卻較困難[1-2]。原因可能為病人通常有許多危險(xiǎn)因素和共存病，如高齡、糖尿病、高糖血癥和高脂血癥等。高脂血癥除誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化外，還能引起心肌氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡增加及線粒體功能障礙等負(fù)面作用，甚至消除再灌注治療策略-缺血預(yù)適應(yīng)和后適應(yīng)的心肌保護(hù)作用[3-4]。越來越多的證據(jù)顯示MIRI能引起細(xì)胞凋亡，凋亡在MIRI病理生理過程中發(fā)揮著重要作用?？梢?，MIRI和脂代謝及凋亡有著緊密的聯(lián)系，研究藥物對(duì)脂代謝、凋亡等多方面的作用將有益于系統(tǒng)防治MIRI。

11β-羥基類固醇脫氫酶1型(11β-HSD1)的致危作用包括胰島素抵抗、血脂異常、高血壓和內(nèi)臟肥胖[5]。溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAATs)能催化溶血磷脂酸(LPA)轉(zhuǎn)變?yōu)榱字醄6]。LPA對(duì)調(diào)節(jié)血小板活化、內(nèi)皮細(xì)胞功能、血管壁的炎癥反應(yīng)及抑制卒中或心肌梗死發(fā)生等具有重要作用[7-9]。張力蛋白同系物(PTEN)是激活突變基因和原癌基因PI3K/Akt的主要負(fù)調(diào)節(jié)物，抑制PTEN能提高PI3K/Akt信號(hào)，降低凋亡，增加存活，進(jìn)而保護(hù)MIRI[10-12]。蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP-2)是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)廣泛表達(dá)的非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶[13]，研究表明，SHP-2因去磷酸化作用，能干擾血管生成素對(duì)MIRI的保護(hù)作用[14]。

香青蘭具有補(bǔ)益心腦、活血化瘀等多種功效，針對(duì)冠心病、心絞痛等綜合癥狀，可顯著改善心肌缺血狀況[15-16]，且其提取物具有降血脂作用[17]?；谥兴幯寤瘜W(xué)及血清藥理學(xué)方法，課題組發(fā)現(xiàn)香青蘭保護(hù)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)為木樨草素、山奈酚、木樨草苷[18-20]。木犀草素和山奈酚均能抑制MIRI損傷[21-22]，但木樨草苷對(duì)離體大鼠MIRI的保護(hù)作用至今未見報(bào)道，且這3種化合物對(duì)脂質(zhì)代謝酶類的影響也未曾開展。

本試驗(yàn)基于參與脂代謝相關(guān)的酶(11β-HSD1和LPAAT)及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(PTEN和SHR-2)考察了香青蘭中木樨草素、山奈酚、木樨草苷對(duì)離體大鼠MIRI的保護(hù)作用，并對(duì)這3種化合物抑制MIRI細(xì)胞凋亡機(jī)制和其影響缺血性心肌病脂代謝相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行了探討，以期為系統(tǒng)防治MIRI提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑

木樨草素(>98%，批號(hào)：H1617004，陜西慧科植物開發(fā)有限公司)；山奈酚(>98%，批號(hào)：B1704016，陜西慧科植物開發(fā)有限公司)；木樨草苷(>98%，批號(hào)：PMF7070602，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司)；雷米普利(武漢華怡達(dá)科技有限公司)，氨基甲酸乙酯(烏拉坦，上海青析化工科技有限公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC，中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司)；胰蛋白酶(美國Invitrogen GIBCO)；高糖DMEM培養(yǎng)基(美國Invitrogen GIBCO)；Bpv(phen)(美國Enzo Life Sciences)；胎牛血清(美國Invitrogen GIBCO)；皮質(zhì)醇ELISA試劑盒(Biovalue)；可的松(南京寶靈科生物技術(shù)有限公司)；NADPH(南京生興生物技術(shù)有限公司)；LPAATβ antibody(美國Santa Cruz Biotechnology)；Goat Secondary Antibodies(美國sigma)；TMB(碧云天生物技術(shù)研究所)。PTEN磷酸酶(美國Echelon Inc)；孔雀綠(美國Echelon Inc)；BpV(pic)(美國Enzo Life Sciences)；SHP-2/PTPN11(美國BPS Bio science)；對(duì)硝基苯磷酸二鈉(pNPP)[梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司]；二硫蘇糖醇(DTT)；HEPES(南京生興生物技術(shù)有限公司)；NSC-87877(CALBIOCHME)。

1.2 動(dòng)物

雌性SPF級(jí)SD大鼠(190～220 g)，80只，購自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(浙)2008-0033。清潔級(jí)ICR小鼠(22～25 g)，雌雄不限，購自南京青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2007-0008。細(xì)胞株：LO2肝細(xì)胞株(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 儀器

GL-2離體心臟灌流系統(tǒng)，HW-1000超級(jí)恒溫水浴，YY-2藥液泵，轉(zhuǎn)換器，生理壓力傳感器(航天醫(yī)學(xué)工程研究所)；BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；BS210S電子天平(德國Sartorius)；HERA Cell 150細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus)；LEGEND Micro 21R型離心機(jī)(美國Thermo scientific)；Safire 2型微孔板測(cè)讀儀(瑞士TECAN)。

2 方法

2.1 離體心臟MIRI模型復(fù)制

大鼠稱質(zhì)量，用烏拉坦腹腔注射麻醉(1 g/kg)，快速開胸取出心臟，置于Locke-Ringer's冰水液中洗凈血液，理出主動(dòng)脈，迅速轉(zhuǎn)移、固定于Langendorff灌流裝置，以充O2的Locke-Ringer's液逆行恒流灌流,溫度控制在(37±0.2)℃，主動(dòng)脈進(jìn)，右心房出；剪開左心耳，插入球囊，調(diào)節(jié)體積以靈敏感應(yīng)為度；灌流15～30 min，用BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)心率(HR)、左室發(fā)展壓(LVDP)等指標(biāo)，待心臟搏動(dòng)達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)后，停止灌流30 min，使心臟缺氧，然后恢復(fù)灌流30 min，使心肌產(chǎn)生再灌注損傷。

2.2 離體心臟MIRI實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

SD大鼠80只，隨機(jī)分為11組，每組7～8只。模型組：按2.1項(xiàng)下方法，穩(wěn)定灌流15 min后，全心停灌30 min，再灌流30 min；木樨草素、山奈酚、木樨草苷各劑量組：同模型組，分別用含木樨草素、山奈酚、木樨草苷100 μmol/L的Locke-Ringer's液通過恒流(0.1、0.2、0.5 mL/min)灌流10 min，停灌30 min，再含藥灌流30 min；陽性藥(雷米普利)組：同模型組，含雷米普利100 μmol/L的Locke-Ringer's液通過恒流(0.2 mL/min)灌流10 min，停灌30 min，再含藥灌流30 min。

2.3 HR、LVDP、左室舒張末壓(LVEDP)、冠脈流量(CF)差測(cè)定

根據(jù)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄表實(shí)時(shí)讀取HR、LVEDP、LVDP和(-dp/dt)/(+dp/dt)。CF測(cè)定：缺血前5 min和復(fù)灌后10 min分別收集1 min灌流液，量取體積。CF差=CF缺血前-CF復(fù)灌后。

2.4 乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定

再灌注15 min末取1 mL灌流液凍存?zhèn)溆茫瑴y(cè)定LDH，檢測(cè)按LDH測(cè)定試劑盒說明書制備反應(yīng)液，于440 nm處測(cè)定OD。

2.5 測(cè)定心肌梗死面積

離體心臟再灌注30 min后，取下心臟立即凍存，自心臟縱軸垂直切成2 mm均勻薄片，共5片，用1% TTC在37 ℃下染色15 min，棄去染色液，生理鹽水沖洗，取出吸去水分拍照。根據(jù)顏色不同區(qū)分各區(qū)域(鮮紅色為危險(xiǎn)區(qū)，蒼白色或粉紅色為梗死區(qū))，稱定總質(zhì)量后將梗死區(qū)分離稱質(zhì)量，計(jì)算其占總心臟比值。

2.6 11β-HSD1活性水平測(cè)定

2.6.1 細(xì)胞培養(yǎng)、建模與給藥 LO2細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)中正常培養(yǎng)，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分組后分別加入藥物：空白組加無血清DMEM培養(yǎng)基；給藥組分別加入木樨草素、山奈酚、木樨草苷、甘草酸單銨鹽于培養(yǎng)基中(終濃度為10 μmol/L)；24 h后，吸棄各組上清液，分別按下列方式加液：空白組加無血清無酚紅DMEM培養(yǎng)基；給藥組分別加可的松(終濃度為50 nmol/L)和NADPH(終濃度為1.2 mmol/L)，并加無血清無酚紅DMEM培養(yǎng)基；模型組同給藥組。培養(yǎng)1 h后，取上清備測(cè)。

2.6.2 檢測(cè)方法 按皮質(zhì)醇ELISA試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)定OD。

2.7 LPAATβ檢測(cè)

2.7.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離 取ICR小鼠肝臟2 g置預(yù)冷離心管中，加入GENMED清理液洗滌1次，切碎組織，再加入預(yù)冷GENMED裂解工作液勻漿，然后將勻漿液移入離心管中4 ℃離心，10 min，1 000×g，吸取上清液至離心管中，4 ℃離心15 min，12 000×g，吸取上清液至離心管中，4 ℃離心60 min，100 000×g，棄上清液，保留沉淀，加入500 mL GENMED保存液，充分混勻，放入-70 ℃冰箱備用。

2.7.2 LPAATβ ELISA法檢測(cè)模型建立 將分離的樣品稀釋成適宜的濃度，加入酶標(biāo)板中，每孔100 μL，在4 ℃下包被12 h，然后用PBST溶液洗板3次。每孔加入10%小牛血清100 μL，37 ℃溫育2 h，然后用PBST溶液洗板3次。每孔100 μL加入用1%NBS稀釋LPAATβ一抗，37 ℃溫育2 h，然后用PBST溶液洗板3次。每孔100 μL加入用1%NBS稀釋的二抗，37 ℃孵育1 h然后用PBST溶液洗板5次。每孔90 μL加入TMB底物。室溫避光孵育，5～10 min后每孔加入50 μL 2.5 mol/L硫酸終止反應(yīng)。在450 nm處測(cè)量OD(酶標(biāo)儀)。

2.7.3 藥物活性測(cè)定 在封閉后加一抗前分別加入100 μL木樨草素、山奈酚、木樨草苷(終濃度為10 μmol/L)，對(duì)照組用100 μL PBS代替，37 ℃孵育2 h。

2.8 PTEN活性檢測(cè)

根據(jù)PTEN試劑盒操作規(guī)程，將PTEN與木樨草素、山奈酚、木樨草苷(終濃度100 nmol/L)在37 ℃預(yù)孵育，5 min后加入3 nmol/L PI P3繼續(xù)孵育，30 min后加入0.8體積孔雀綠試劑停止反應(yīng)，然后在625 nm處測(cè)定OD，PTEN活性以生成的H3PO4水平反映。

2.9 SHP-2活性測(cè)定

加35 μL檢測(cè)緩沖液(119.15 mg HEPES，7.444 8 mg EDTA，4.626 mg DTT，58.44 mg NaCl依次溶解于9 mL三蒸水中，調(diào)節(jié)pH值為7.4，定容至10 mL)于96孔板，再加10 μL供試藥溶液(終濃度均為10 μmol/L)，預(yù)熱至30 ℃，然后加5 μL SHP-2到檢測(cè)緩沖液與供試藥混合液中(空白孔不加)，靜置10 min，再加入50 μL pNPP儲(chǔ)備液，充分混勻(pNPP終濃度為50 mmol/L)，最后于405 nm進(jìn)行動(dòng)態(tài)測(cè)定硝基苯酚的OD。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 木樨草素、山奈酚和木樨草苷對(duì)HR、LVEDP、LVDP和(-dp/dt)/(+dp/dt)的影響

3.1.1 木樨草素對(duì)HR、LVEDP、LVDP和(-dp/dt)/(+dp/dt)的影響 圖1～2顯示，各組給藥后和未處理時(shí)相比，各參數(shù)未發(fā)生顯著性改變，但缺血/再灌注(I/R)后，與缺血前比較，模型組HR顯著升高，LVDP、LVEDP和(-dp/dt)/(+dp/dt)顯著降低(P<0.05～0.01)，木樨草素各劑量組(1、2、5 μmol/L)和陽性對(duì)照藥雷米普利組HR升高不顯著，LVDP、LVEDP和(-dp/dt)/(+dp/dt)有一定程度降低，與模型組比較，有顯著性差異(P<0.05)，并顯示一定的量效關(guān)系，表明木樨草素具有一定的保護(hù)MIRI的作用。

3.1.2 山奈酚對(duì)HR、LVDP、LVEDP和(-dp/dt)/(+dp/dt)的影響 圖2～3顯示，各組給藥后和未處理時(shí)相比，各參數(shù)未發(fā)生顯著性改變，但I(xiàn)/R后，與缺血前比較，模型組和陽性對(duì)照藥雷米普利組對(duì)HR、LVDP、LVEDP和(-dp/dt)/(+dp/dt)的影響同前，山奈酚各劑量組(1、2、5 μmol/L)HR升高不顯著，LVDP、LVEDP和(-dp/dt)/(+dp/dt)有一定程度降低，與模型組比較，有顯著性差異(P<0.05)，并顯示一定劑量依賴關(guān)系，表明山奈酚具有一定的保護(hù)MIRI的作用。

3.1.3 木樨草苷對(duì)HR、LVDP、LVEDP和(-dp/dt)/(+dp/dt)的影響 圖2和圖4顯示，各組給藥后和未處理時(shí)相比，各參數(shù)未發(fā)生顯著性改變，但I(xiàn)/R后，與缺血前比較，模型組和陽性對(duì)照藥雷米普利組對(duì)HR、LVDP、LVEDP和(-dp/dt)/(+dp/dt)的影響同前，木樨草苷中、高劑量組(2、5 μmol/L)HR升高不顯著，LVDP和LVEDP降低不顯著，3個(gè)劑量組(-dp/dt)/(+dp/dt)均一定程度降低，與模型組比較，有顯著性差異(P<0.05)，并顯示一定劑量依賴關(guān)系，表明木樨草苷具有一定的保護(hù)MIRI的作用。

3.2 木樨草素、山奈酚和木樨草苷對(duì)CF差、LDH和梗死區(qū)比重的影響

表1顯示，與正常組比較，模型組CF差、LDH釋放量和梗死區(qū)比重顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性對(duì)照藥雷米普利、木樨草素、山奈酚和木樨草苷3個(gè)劑量組(1、2、5 μmol/L)均顯著降低CF差、LDH釋放量和梗死區(qū)比重(P<0.05)，并顯示一定的劑量依賴關(guān)系。表明3個(gè)黃酮化合物通過保護(hù)心肌梗死和細(xì)胞破壞發(fā)揮保護(hù)MIRI的作用。

表1 木樨草素、山奈酚和木樨草苷對(duì)CF差、LDH和梗死區(qū)比重的影響

注：與正常組比較，##P<0.01;與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01。

3.3 木樨草素、山奈酚、木樨草苷對(duì)11β-HSD1的抑制作用

圖5顯示，與正常組相比，模型組氫化可的松含量顯著升高(P<0.01)，表明11β-HSD1具有很強(qiáng)的活性。給藥預(yù)處理后，與模型組比較，木樨草素、山奈酚、木樨草苷及陽性對(duì)照藥甘草酸單銨鹽組氫化可的松含量均顯著降低(P<0.05)，表明11β-HSD1活性受到了抑制。

3.4 木樨草素、山奈酚、木樨草苷對(duì)LPAATβ的抑制作用

LPAATβ活性抑制作用結(jié)果顯示，木樨草素、山奈酚、木樨草苷作用顯著(P<0.05)，最高抑制率達(dá)32.9%。見圖6。

3.5 木樨草素、山奈酚、木樨草苷對(duì)PTEN活性抑制作用

圖7顯示，與正常組比較，加入藥物預(yù)處理后，木樨草素、山奈酚、木樨草苷及陽性對(duì)照藥bpv(phen)能顯著抑制PTEN的活性(P<0.01)，其中山奈酚抑制作用最強(qiáng)。

3.6 木樨草素、山奈酚、木樨草苷對(duì)SHP-2活性抑制作用

圖8A顯示，在1～16 min檢測(cè)時(shí)間內(nèi)，木樨草素、山奈酚、木樨草苷和陽性對(duì)照藥NSC-87877對(duì)SHP-2活性均有抑制作用；以4 min為對(duì)比時(shí)間點(diǎn)，與正常組比較有顯著性差異(P<0.05)，但3個(gè)化合物抑制作用強(qiáng)度無明顯差異(圖8B)。

4 討論

木樨草素、山奈酚和木樨草苷均可減輕MIRI后心肌梗死面積，改善CF，減少心肌標(biāo)志酶LDH的漏出，改善灌注后左心室收縮功能，并顯示一定的量效關(guān)系，表明3個(gè)化合物具有保護(hù)MIRI的作用，且通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)3個(gè)化合物作用強(qiáng)度相當(dāng)。

11β-HSD1主要在肝臟、骨骼肌、脂肪等組織中表達(dá)，是一種依賴NADP(H)的還原酶。因此本研究選擇正常肝細(xì)胞LO2細(xì)胞，以可的松為底物，甘草酸為11β-HSD1抑制劑，建立藥物篩選模型。木樨草素、山萘酚、木樨草苷均能顯著抑制催化糖皮質(zhì)激素代謝的11β-HSD1，避免發(fā)生胰島素抵抗，從而預(yù)防高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等代謝綜合征的發(fā)生，進(jìn)而預(yù)防缺血性心肌病的發(fā)生或有助于MIRI的治療，其中山奈酚作用最強(qiáng)。

由于LPAATβ具有組織表達(dá)特異性，本研究從小鼠肝臟組織(或肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng))中提取獲得LPAATβ，再建立ELISA模型。由于尚無明確效果的LPAATβ的抑制劑，故未設(shè)陽性對(duì)照組。研究結(jié)果顯示，木樨草素、山奈酚、木樨草苷對(duì)LPAATβ具有良好的抑制作用，表明3個(gè)化合物能提高LPA的含量，從而間接發(fā)揮在防治卒中或心肌梗死等疾病中的作用，同時(shí)表明LPAATβ在心肌缺血中的作用值得研究。

在許多細(xì)胞中PTEN是潛在的PI3K活性負(fù)調(diào)節(jié)因子[23]，抑制PTEN是誘導(dǎo)保護(hù)MIRI的潛在靶點(diǎn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，抑制PTEN在MIRI后的心肌存活中具有治療作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)木樨草素、山奈酚、木樨草苷對(duì)PTEN活性均有顯著性抑制作用，與陽性對(duì)照藥bpV(pic)作用強(qiáng)度相當(dāng)，表明木樨草素、山奈酚、木樨草苷保護(hù)MIRI可能與其抑制PTEN靶點(diǎn)相關(guān)。當(dāng)然，木樨草素、山奈酚、木樨草苷在體內(nèi)對(duì)PTEN活性是否具有相同或相當(dāng)?shù)囊种谱饔?，有待進(jìn)一步研究。

SHP-2是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的酪氨酸激酶途徑中的信號(hào)分子，當(dāng)前國內(nèi)外對(duì)其正常生理作用的研究較多，但其表達(dá)異常與疾病的關(guān)系報(bào)道較少[24]。本研究結(jié)果顯示，木樨草素、山奈酚、木樨草苷對(duì)SHP-2活性均有抑制作用。

木樨草素、山奈酚、木樨草苷均為黃酮類化合物，在多種中藥、蔬菜和水果中均有分布。中藥與天然藥物中含有多種有效成分，它們通常共同發(fā)揮藥效作用。中藥與天然藥物中的多成分、多靶點(diǎn)之間的協(xié)同作用特點(diǎn)是中藥藥理機(jī)制研究中的重要層面。中藥有效成分的多樣性可契合生物多靶，而生物靶標(biāo)間的協(xié)同作用是中藥藥效機(jī)制的重要補(bǔ)充。一些多成分、多靶點(diǎn)藥物對(duì)于復(fù)雜疾病起到了很好的治療效果，是對(duì)經(jīng)典的“一藥一靶”藥物發(fā)現(xiàn)理念的有效補(bǔ)充。本研究旨在考察3種黃酮類成分——木樨草素、山奈酚、木樨草苷對(duì)MIRI的保護(hù)作用及其降脂和抗凋亡作用機(jī)制，期望為中藥“多成分、多靶點(diǎn)”作用模式研究提供實(shí)例支持，為全面防治MIRI提供依據(jù)。