黃天一，陳婷婷，崔杰，李夢雨，華永慶,3

(1.南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇 南京 210023；2.江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210023；3.江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

骨質疏松癥(OP)是一種代謝性骨疾病，最終導致骨強度降低和骨折風險增加[1]。隨著人口老齡化加劇，OP造成的公共衛(wèi)生負擔日益嚴重[2]，發(fā)現(xiàn)新的治療藥物仍是當前亟待解決的問題。成骨細胞介導的骨形成，在維持骨穩(wěn)態(tài)中起到關鍵作用[3-4]。在OP形成過程中，機體內環(huán)境改變導致氧化應激(OS)水平增加，使得成骨細胞凋亡增加，骨穩(wěn)態(tài)平衡被打破。因而，降低機體OS水平，抗成骨細胞凋亡對維持骨穩(wěn)態(tài)具有重要意義。阿魏酸(FA)是一種酚酸類成分，是抗OP常用中藥當歸、川芎的有效成分之一。FA被證實具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種生物活性[5]。近來研究發(fā)現(xiàn)FA可以預防卵巢切除大鼠的骨質流失[6]。當阿魏酸直接作用于成骨細胞時,可促進體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞的增殖，顯著性增加ALP活性和鈣化結節(jié)的數(shù)量[7]，但對其作用機制尚缺乏深入研究。OP的發(fā)生與雌激素受體(ER)信號通路密切相關[8]。新型膜雌激素受體G蛋白偶聯(lián)受體GPR30因其可介導雌激素的非基因組效應，避免ER經(jīng)典途徑的不良反應而受到關注，其在骨代謝疾病中的調控作用也不斷得到證明[9]。中藥抗OP活性成分槲皮素可以通過GPR30抑制破骨細胞的分化[10]，櫻黃素選擇性結合GPR30活化MAPK信號通路，促進成骨細胞增殖分化[11]。FA抗成骨細胞凋亡、清除活性氧(ROS)的作用是否與GPR30相關仍不清楚。本實驗旨在研究FA對成骨細胞凋亡的影響，并探討其與GPR30相關的作用機制，為進一步發(fā)現(xiàn)OP治療藥物奠定基礎。

1 材料

1.1 藥品與試劑

MC3T3-E1細胞購自中國科學院上海細胞庫，品系：小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14；FITC AnnexinV Apoptosis Detection Kit Ⅰ(批號:8072965)購自BD Pharmingen;Bcl-2(批號:00062312)、β-tubulin兔單克隆抗體(批號:00056545)、FoxO3a兔單克隆抗體(批號:00055690)均購自Proteintech公司；G15(批號：3678/10)購自TOCRIS公司；過氧化氫(H2O2)購自南京寧試化學試劑有限公司；胎牛血清(批號：1715753)、α-MEM培養(yǎng)基(批號：1867733)購自GBICO公司；青霉素-鏈霉素(批號：L40523)購自北京全式金生物科技有限公司；FA(貨號：B20007)購自上海源葉生物科技有限公司；ROS檢測試劑盒(貨號：S0033)購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 實驗儀器

Synergy2型多功能酶標儀(Bio-Tek，美國);C6流式細胞儀(BD Accuri，美國);Chemi Doc TMXRS+數(shù)字化凝膠成像工作站(BIO-RAD，美國);SPX-150型生化培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司);M205FA型體式熒光顯微鏡(Leica，德國);MCO-20AIC CO2細胞培養(yǎng)箱(三洋，日本);Observer Z1活細胞成像分析系統(tǒng)(Zeiss，德國)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

MC3T3-E1細胞用含10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的α-MEM完全培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。當細胞長至密度85%左右，用含0.25%EDTA的胰酶消化，終止消化后，1 000 r/min條件下離心3 min，進行傳代，培養(yǎng)過程中每2～3 d更換培養(yǎng)基。

2.2 MTT檢測細胞活力

2.2.1 FA對MC3T3-E1細胞活力的影響 取處于對數(shù)生長期的細胞，消化，以每孔5 000個種于96孔板中，分為對照組,1、10、25、50、100、200、400 μmol/L FA組，每孔加入100 μL培養(yǎng)基孵育24 h，待細胞貼壁后對照組加入含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基，其余組加入相應濃度含藥培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h，吸盡上清液，避光每孔加入200 μL單培和20 μL 5 mg/mL MTT溶液，4 h后吸盡上清，每孔換成150 μL DMSO溶液吹勻，并在490 nm處檢測吸光度值。

2.2.2 FA對H2O2誘導后的細胞活力的影響 細胞種植密度為每孔104個，分為對照組，H2O2組,0.1、1、10、25、50、100、200、400 μmol/L FA組，每孔加入100 μL培養(yǎng)基孵育24 h。除對照組外，每組換成含400 μmol/L H2O2的培養(yǎng)基，4 h后換成相應濃度含藥培養(yǎng)基，重復上述操作。

2.3 流式及熒光圖片采集

MC3T3-E1細胞種于60 mm×15 mm培養(yǎng)皿中，分為對照組、H2O2組和給藥組，待細胞密度為60%左右時，加入400 μmol/L H2O2誘導細胞損傷，4 h后換成含藥培養(yǎng)基。24 h后對細胞進行以下處理。

2.3.1 細胞凋亡檢測 用800 μL不含EDTA的胰酶消化4 min，同體積完全培養(yǎng)基終止消化后，用1 mL D-hanks清洗細胞，1 000 r/min條件下離心3 min，棄去上清液，按照Annexin∶PI∶結合液=25∶25∶500的條件對細胞進行染色，常溫孵育20 min后即可上機處理。

2.3.2 ROS流式檢測 采用含0.25%EDTA的胰酶消化30 s，終止消化后用D-hanks清洗細胞，1 000 r/min條件下離心3 min，棄去上清液，加入DCFH-DA∶D-hanks=1∶1 000的工作液進行染色，37 ℃孵育30 min后，D-hanks清洗細胞2遍，并最終加入400 μL D-hanks上機處理。

2.3.3 ROS熒光采集 用D-hanks對皿內進行清洗，加入DCFA-DA∶D-hanks=1∶1 000的工作液進行染色，37 ℃孵育30 min后，D-hanks清洗細胞，在波長488 nm下活細胞成像進行圖像采集。

2.4 Western blot分析

MC3T3-E1細胞以每孔3×105個種于6孔板中，分為對照組、H2O2組和給藥組，待細胞密度為60%左右時，加入400 μmol/L H2O2誘導細胞損傷，4 h后換成含藥培養(yǎng)基。24 h后將細胞按照BCA法蛋白提取試劑盒說明書進行處理。Western blot法在恒流40 mA的條件下電泳90 min，恒壓100 V的條件下轉膜90 min，5%BSA封閉1 h，一抗過夜，再孵育1 h二抗。檢測Bcl-2的表達，并選取β-tubulin作為內參。

2.5 免疫熒光檢測

MC3T3-E1細胞以每孔4×104個種于放有玻片的12孔板中，分為對照組、H2O2組、FA給藥組和G15拮抗劑組，待細胞密度為60%左右時，加入400 μmol/L H2O2誘導細胞損傷，4 h后換成含藥培養(yǎng)基(對照組、H2O2組為完全培養(yǎng)基，給藥組為含50 μmol/L FA的完全培養(yǎng)基，抑制劑組為含50 μmol/L FA和100 nmol/L G15的完全培養(yǎng)基)。24 h后將玻片取出置于干凈的12孔板中，PBS洗滌附著的培養(yǎng)基，甲醇固定后用2%Triton破膜15 min，1.5%BSA封閉后一抗過夜，第2天回收一抗，IgG-FITC避光孵育1 h后PBS清洗，采用DAPI對細胞核進行染色，PBS洗滌殘余染液后在激發(fā)波長488、370 nm條件下用活細胞工作站進行圖像采集，并用Image J軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2.6 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 FA對H2O2誘導后MC3T3-E1細胞活力的影響

在正常狀態(tài)下，與對照組相比，不同濃度(1、10、25、50、100、200、400 μmol/L)FA對MC3T3-E1細胞活力并無顯著影響(圖1)。在過氧化損傷狀態(tài)下，與對照組相比，H2O2組細胞活力明顯降低(P<0.05)，25、50、100、200和400 μmol/L FA組細胞活力較H2O2組顯著升高(P<0.05～0.01)(圖2)，且100 μmol/L FA組升高趨勢最為明顯。

3.2 FA對H2O2誘導的MC3T3-E1細胞凋亡率的影響

結果發(fā)現(xiàn)H2O2能造成MC3T3-E1細胞凋亡率增加，而FA干預后，較H2O2組顯著降低(圖3)。Western blot結果表明，與H2O2組相比，10、25、50、100 μmol/L FA均能不同程度地促進抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(P<0.05～0.01)(圖4)。結果表明25、50、100 μmol/L FA具有較為穩(wěn)定的抗MC3T3-E1細胞凋亡能力。

3.3 FA對H2O2誘導的MC3T3-E1細胞ROS的影響

流式結果顯示，與對照組相比，H2O2組ROS水平明顯升高，25、50 μmol/L FA干預后MC3T3-E1細胞內ROS含量明顯下降(圖5)?；钚匝鯚晒鈭D像采集數(shù)據(jù)分析結果表明不同濃度FA能顯著清除細胞內H2O2刺激下異常升高的ROS(P<0.05～0.01)，且25、50 μmol/L FA效果較為顯著(圖6)，為了實驗結果更為穩(wěn)定，采用50 μmol/L FA進行后續(xù)實驗。

3.4 GPR30對FA抗凋亡和抗氧化作用的影響

流式結果表明，GPR30特異性抑制劑G15單用對MC3T3-E1細胞凋亡并無明顯影響(圖7A)，F(xiàn)A組較H2O2組細胞凋亡率顯著降低，100 nmol/L G15組細胞凋亡率較FA組明顯升高(圖7B)(P<0.01)，這表明G15對FA抗凋亡能力有抑制作用。ROS流式結果顯示，G15組較FA組細胞內ROS水平明顯升高(P<0.01)(圖8)，與熒光采集結果所呈現(xiàn)的相同(圖9)，說明G15對FA抗OS能力有抑制作用。提示GPR30可能是FA發(fā)揮抗氧化和抗凋亡作用的關鍵影響因子。

3.5 GPR30干預FA對OS狀態(tài)下FoxO3a的核易位的影響

免疫熒光結果顯示，H2O2組FoxO3a在細胞核內的含量較對照組增加，50 μmol/L FA干預后FoxO3a在細胞核內含量較H2O2組明顯減少(圖10)，說明FA可以阻止過氧化損傷后FoxO3a的核易位；給予100 nmol/L G15之后，相較于50 μmol/L FA組FoxO3a的核易位明顯增多，說明在G15作用下FA阻礙FoxO3a核易位的能力明顯降低。表明FA可能通過GPR30影響FoxO3a的核易位。

4 討論

骨穩(wěn)態(tài)依賴于骨形成和骨吸收之間的動態(tài)平衡，當骨形成速率低于骨吸收速率時可引發(fā)OP。在OP患者中，女性發(fā)病率遠高于男性[12]，這可能與女性絕經(jīng)后雌激素驟降有關。雌激素缺乏會降低機體對OS的防御能力并加速骨骼的衰老[13]。OS是由ROS過量引起的氧化還原失衡，研究表明，細胞中ROS水平升高會通過各種分子級聯(lián)激活Bcl-2、Bax等凋亡相關蛋白的表達，最終介導細胞凋亡[14]。在成骨細胞中，OS通過抑制成骨細胞前體細胞成熟，降低成骨細胞分化率，并誘導其凋亡[15]?？梢?，雌激素缺乏引起的OS是骨形成抑制的關鍵影響因素。

雌激素是具有廣泛生物活性的類固醇激素。傳統(tǒng)認為，雌激素通過其受體ERα和ERβ介導下游信號通路發(fā)揮抗OP作用[16]，但是該途徑的激活會導致乳腺癌和子宮內膜增生等副作用[17]。近年來研究發(fā)現(xiàn)位于細胞膜上的雌激素受體亞型GPR30具有重要的骨保護作用[18]。GPR30敲除后大鼠骨骼生長被顯著抑制[19]，GPR30特異性激動劑G1可以增加大鼠骨密度，并可避免雌二醇引起的子宮上皮細胞增殖[20]，子宮質量增加[21]。不同于傳統(tǒng)的ERα和ERβ，GPR30主要位于細胞膜上，通過非基因組效應快速激活細胞內的第二信號系統(tǒng)，激活PI3K/Akt、MAPK等信號通路并引起下游反應[22]，而非通過傳統(tǒng)認識的雌激素效應元件發(fā)揮作用。這提示，通過特異性激活GPR30途徑可能可以避免傳統(tǒng)雌激素替代療法因激活ERα引起的子宮內膜增生等副作用。而中藥中廣泛存在著與GPR30通路相關的活性成分[23-25]。這些研究表明GPR30可能是中藥活性成分干預成骨細胞存活和凋亡的重要調控因子。

在前成骨細胞中，F(xiàn)oxO3通過調控Wnt/β-catenin信號通路，在增殖、分化成熟和骨基質礦化等方面扮演著十分重要的角色。有研究證實，ROS積累后，F(xiàn)oxOs易位至細胞核，與TCF競爭性結合β-catenin，最終減少成骨細胞的增殖與分化[26]。GPR30對OS具有重要的調控作用[27]。雌激素通過GPR30介導FoxO3的失活[28]。最新研究表明，F(xiàn)oxO3進入細胞核后，可下調抗凋亡基因Bcl-2的表達，并上調促凋亡基因Bim的表達，最終引起細胞凋亡[29-30]。本研究表明FA可通過GPR30干預OS狀態(tài)下的FoxO3a核易位，進而發(fā)揮抗凋亡作用。

綜上所述，F(xiàn)A具有抗成骨細胞凋亡和降低ROS水平的作用，并可阻礙過氧化損傷后FoxO3a的核易位，其機制可能與GPR30有關。本研究提出FA可能通過激活GPR30抗成骨細胞凋亡，這提示其可能在治療OP中發(fā)揮作用。本研究為闡明中藥活性成分抗骨質疏松作用機制提供新的思路，為臨床尋找新的OP治療藥物奠定了基礎。