趙婷婷 陳倩 夏志林 王軍 喻奇?zhèn)? 王磊 聶瓊 劉洋 劉仁祥

摘 ?要：為拓寬煙草不育基因的來(lái)源，依據(jù)辣椒雄性不育基因Cams1序列，在煙草品種K326中同源克隆獲得基因Ntms1，采用生物信息學(xué)方法對(duì)辣椒Cams1基因和煙草Ntms1基因的核苷酸序列、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、親疏水性及結(jié)構(gòu)域等進(jìn)行分析，并利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)Ntms1基因功能進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，Cams1基因和Ntms1基因的蛋白質(zhì)序列相似度為85.25%，基因編碼產(chǎn)物具有相同的PHD功能結(jié)構(gòu)域，都具有磷酸化識(shí)別位點(diǎn)，有相似的二級(jí)和三級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，且兩個(gè)基因都沒(méi)有信號(hào)肽和跨膜區(qū)的結(jié)構(gòu)，推測(cè)煙草Ntms1基因與辣椒不育基因Cams1具有相似的控制育性功能。遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果表明，突變株的Ntms1基因表達(dá)量和有活力花粉量極顯著低于野生型植株，證明了煙草Ntms1基因具有控制煙草花粉育性功能。

關(guān)鍵詞：煙草;雄性不育;ms1基因;生物信息學(xué);遺傳轉(zhuǎn)化

Homologous Cloning and Bioinformatics Analysis of Gene Cams1 in Tobacco

ZHAO Tingting1， CHEN Qian1， XIA Zhilin2， WANG Jun2， YU Qiwei3， WANG Lei1，

NIE Qiong1， LIU Yang1， LIU Renxiang1*

（1. College of Tobacco， Guizhou University， Guizhou Key Laboratory for Tobacco Quality Research， Guiyang 550025， China;

2. Zunyi Tobacco Company， Zunyi， Guizhou 564000， China; 3. Bijie Tobacco Company， Bijie， Guizhou 551700， China）

Abstract： To broaden the source of tobacco sterility genes， based on the capsicum male sterility gene Cams1 sequence， the gene Ntms1 was homologously cloned in tobacco variety K326. Bioinformatics method was employed to analyze the nucleotide sequence， protein structure， hydrophilicity and domain of Capsicum gene Cams1 and tobacco gene Ntms1， and the function of Ntms1 was verified by using CRISPR/Cas9 technique. Results showed that the protein sequence similarity of Cams1 and Ntms1 reached 85.25%， with the products encoded by the two genes having same PHD functional domain， same phosphorylation recognition site， similar secondary and tertiary protein structures， and the two genes had no signal peptide and transmembrane structure. It was speculated that tobacco Ntms1 gene and pepper sterile gene Cams1 had similar function of fertility control. The results of genetic transformation showed that the expression of Ntms1 and the amount of active pollen in the mutant were highly significantly lower than that in the wild type， which proved that Ntms1 had the function of tobacco pollen fertility control.

Keywords： tobacco; male sterility; ms1 gene; bioinformatics; genetic transformation

植物雄性不育（male sterility，MS）是指植物雄性生殖器官發(fā)育異常而營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)及雌性生殖器官發(fā)育都正常的現(xiàn)象[1]，在作物育種和分子生物學(xué)研究中具有重要作用[2]。利用雄性不育生產(chǎn)雜交種，可省去人工去雄，降低制種成本、提高種子純度。

煙草生產(chǎn)的收獲物是葉片，為了控制品種布局及實(shí)現(xiàn)煙葉定位生產(chǎn)，除利用不育雜交種外，往往也將雜交選育的純系品種轉(zhuǎn)育成不育系在生產(chǎn)上利用。目前，煙葉生產(chǎn)上利用的不育系來(lái)源單一，僅有來(lái)源于N.suaveolens的胞質(zhì)不育基因成功利用，導(dǎo)致煙草雜交種和不育系的生產(chǎn)應(yīng)用存在極大風(fēng)險(xiǎn)，因此，不育性的研究對(duì)于煙草極為重要。在煙草雄性不育性的研究中，前人多集中在不育胞質(zhì)基因的研究上，發(fā)現(xiàn)了atp6、atp9、orf25以及orfB等不育胞質(zhì)基因，而煙草不育核基因研究較少[3]，李勝國(guó)等[4]、SCHMULLING等[5]、耿颯等[6]利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建出MS系煙草，但未報(bào)道控制煙草育性的細(xì)胞核基因;擬南芥[7]、玉米[8]、水稻[9]等作物雄性不育的研究，獲得了多個(gè)控制作物不育性的核基因。ZOE[7]等發(fā)現(xiàn)，擬南芥ms1突變體在早期發(fā)育階段都表現(xiàn)正常，在小孢子釋放階段，小孢子的細(xì)胞質(zhì)和絨氈層開(kāi)始出現(xiàn)異常液泡化和降解，導(dǎo)致成熟花粉囊中沒(méi)有活性花粉粒。擬南芥ms1突變體能夠?qū)е禄ǚ蹟∮?，而?duì)其他器官的生長(zhǎng)發(fā)育沒(méi)有不良影響[10]，具有較大的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值;KYUMI等[11]在辣椒上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)和擬南芥中ms1基因高度同源的雄性不育基因Cams1（登錄號(hào)CA05g06780）。為了拓寬煙草不育性的來(lái)源，本研究通過(guò)同源克隆方法，根據(jù)辣椒Cams1基因序列，從煙草中同源克隆出Ntms1基因，運(yùn)用生物信息學(xué)和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)該基因功能進(jìn)行分析，對(duì)于促進(jìn)煙草雄性不育性的研究及拓寬煙草不育性的來(lái)源有較為重要的科學(xué)意義和實(shí)踐價(jià)值。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

1.1.1 ?植物材料與遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基 ?試驗(yàn)所用烤煙品種K326由貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。遺傳轉(zhuǎn)化所用培養(yǎng)基配方參照文獻(xiàn)[13]。

1.1.2 ?載體與菌株 ?本試驗(yàn)所采用的大腸桿菌Escherichia coli菌株DH5α，農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105均由貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存并提供;克隆載體pMD18-T vetor T由陜西博瑞德生物科技有限公司提供;CRISPR/Cas9重組載體MSG2靶點(diǎn)設(shè)計(jì)與比對(duì)在貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，CRISPR/Cas9重組載體合成由百格基因科技（江蘇）有限公司完成。

1.2 ?試驗(yàn)方法

1.2.1 ?總RNA提取及cDNA合成 ?采用RNAiso Plus Tri Zol（Ta Ka Ra）提取總RNA。采用Poly A Ttract? mRNA Isolation System Ⅲ with Magnetic Stand（Promega）試劑盒合成cDNA，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2.2 ?普通煙草Ntms1的PCR擴(kuò)增及克隆 ?從NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得辣椒ms1蛋白的氨基酸序列Cams1，用此氨基酸序列與普通煙草進(jìn)行比對(duì)，找到與之同源性較高的類ms1蛋白，以其氨基酸序列獲得煙草中ms1基因的序列（GenBank登錄號(hào)為L(zhǎng)OC107813657），用此序列在Primer6.0軟件中設(shè)計(jì)特異性引物657-F（ATGGTGGTAATGAATGGAAGGCC）/657-R（TCA

GGCAGCATTAGTCAAGC），以普通煙草K326品種的葉片cDNA為模板，擴(kuò)增LOC107813657基因的CDS序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶連接到T載體，送往陜西博瑞德生物科技有限公司測(cè)序，并將序列命名為Ntms1。

1.2.3 ?生物信息學(xué)分析 ?利用NCBI中的ORF （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）確定辣椒Cams1及煙草Ntms1基因編碼蛋白質(zhì)的開(kāi)放閱讀框;ProtParam系統(tǒng)（https：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（PI）、消光系數(shù)及不穩(wěn)定系數(shù)等理化性質(zhì);Protscale（https：//web.expasy.org/protscale/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的親疏水性;Inter-Pro（http：//www.ebi. ac.uk/interpro/）分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域;NetPhos 3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn);SOPMA分析和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu);Phyre2分析預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu);TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域。Signal P4.1 分析蛋白質(zhì)是否含有信號(hào)肽;DNAMAN 軟件對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行相似性比對(duì);MEGA7.0 軟件構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 ?煙草Ntms1的功能驗(yàn)證 ?（1）遺傳轉(zhuǎn)化：采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)[14]的煙草葉片遺傳轉(zhuǎn)化法。

（2）陽(yáng)性植株篩選：以提取轉(zhuǎn)化植株DNA為模板，用Cas9載體序列特異引物Cas9-F（CACCAT CTACCACCTGAGAA）/Cas9-R（CGAAGTTGCTCT TGAAGTT）及潮霉素抗性基因特異引物HYG-F（CTCGTGCTTTCAGCTTCGATGT）/HYG-R（TGT CGTCCATCACAGTTTGCCA），對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行篩選。

（3）陽(yáng)性植株基因測(cè)序：設(shè)計(jì)引物Ntms1-1F（TCCTACAAATAGGCTCCGAGA）/Ntms1-1R（TGCACGATTTGCACCTAGAC），以轉(zhuǎn)化陽(yáng)性單株DNA為模板擴(kuò)增靶位點(diǎn)序列，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

（4）突變植株Ntms1基因表達(dá)量分析：以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，根據(jù)Ntms1序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物PHD_F（ATGTTGGCTTGTGATGT CTG）/ PHD_R（TTCCCGCTTGTATTTGTAGTC），以煙草Actin內(nèi)參基因引物Actin-F（CATGAAGATTAA

AGGCGGAGTG）/Actin-R（AACAGTTTGGTTGGA GTTCTGG）進(jìn)行Ntms1基因表達(dá)量分析。

（5）突變植株花粉活力鑒定：盛花期時(shí)取即將成熟開(kāi)裂的花藥，解剖針去除花藥壁，挑出全部花粉，經(jīng)200 ?L碘鉀（I-KI）染色液染色混勻后，在顯微鏡（40×）下觀察花粉形態(tài)及染色情況，每株植株隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算染色花粉數(shù)量。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?目的基因的擴(kuò)增及克隆

單菌落PCR方法陽(yáng)性克隆鑒定結(jié)果（圖1）顯示，有與目的基因條帶大小一致的條帶，說(shuō)明克隆成功。

2.2 ?煙草Ntms1生物信息學(xué)分析

2.2.1 ?開(kāi)放閱讀框分析 ?對(duì)基因的開(kāi)放閱讀框進(jìn)行定位，辣椒Cams1起始密碼子位于第1個(gè)核苷酸，終止密碼子位于第2100個(gè)核苷酸，共編碼699個(gè)氨基酸;煙草Ntms1起始密碼子位于第36個(gè)核苷酸，終止密碼子位于第2174個(gè)核苷酸，共編碼712個(gè)氨基酸;兩個(gè)基因編碼區(qū)相互重疊，編碼氨基酸數(shù)量相差極小，說(shuō)明兩個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)差異不大。

2.2.2 ?理化性質(zhì)分析 ?從理化分析結(jié)果（表1）看出，兩個(gè)基因各理化性質(zhì)指標(biāo)都極為接近。

2.2.3 ?蛋白比對(duì) ?相似性比對(duì)結(jié)果得出Cams1基因和Ntms1基因編碼的蛋白質(zhì)相似度為85.25%，氨基酸序列有較高的相似度（圖2）。

2.2.4 ?親疏水性分析 ?親疏水性（圖3）分析初步認(rèn)為兩種蛋白質(zhì)均具有較強(qiáng)的親水性。

2.2.5 ?功能結(jié)構(gòu)域分析 ?結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果所示，Cams1、Ntms1基因編碼產(chǎn)物都具有相同的PHD結(jié)構(gòu)域。

2.2.6 ?二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) ?對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)（表2）和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果可以看出二者空間結(jié)構(gòu)相似度很高。

2.2.7 ?磷酸化位點(diǎn)分析 ?磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果顯示，Cams1、Ntms1都是具有蛋白激酶活性的受體。

2.2.8 ?信號(hào)肽及跨膜區(qū)分析 ?信號(hào)肽分析預(yù)測(cè)顯示，Cams1、Ntms1蛋白都無(wú)信號(hào)肽序列特征，由此預(yù)測(cè)兩者均為非分泌蛋白。進(jìn)一步對(duì)跨膜區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，Cams1、Ntms1蛋白都不存在跨膜區(qū)，均為非跨膜蛋白。

2.2.9 ?系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 ?在NCBI網(wǎng)站上選取具有雄性不育功能的物種進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果所示（圖4），Cams1、Ntms1親緣關(guān)系比較近。

經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)初步分析，Cams1、Ntms1二者基因結(jié)構(gòu)及編碼的蛋白質(zhì)性質(zhì)差異極小，可以初步推測(cè)煙草Ntms1可能與辣椒Cams1具有相同的控制育性的功能。

2.3 ?煙草Ntms1基因突變效應(yīng)分析

2.3.1 ?陽(yáng)性植株篩選 ?對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行Cas9基因及HYG潮霉素基因進(jìn)行PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，均擴(kuò)增出與預(yù)期產(chǎn)物大小相同的目的條帶（圖5），說(shuō)明Cas9基因已經(jīng)進(jìn)入植株體內(nèi)。

2.3.2 ?陽(yáng)性植株目的基因測(cè)序 ?對(duì)獲得的轉(zhuǎn)化陽(yáng)性植株用靶點(diǎn)檢測(cè)引物對(duì)靶點(diǎn)上下游區(qū)域進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果表明，6株陽(yáng)性植株均發(fā)生了編輯（圖6）。

2.3.3 ?突變植株基因表達(dá)分析 ?RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果顯示（圖7），將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并分別用煙草內(nèi)參基因和Ntms1基因熒光定量引物對(duì)所得cDNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，條帶指示的大小與預(yù)期大小一致。

對(duì)6株突變植株進(jìn)行基因表達(dá)量分析，結(jié)果如圖8所示，6株突變株的Ntms1基因表達(dá)量較野生型均發(fā)生不同程度的降低，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，與野生型植株相比，突變株目的基因相對(duì)表達(dá)量均達(dá)到了極顯著差異，進(jìn)一步說(shuō)明CRISPR/Cas9載體在煙草植株體內(nèi)對(duì)目的基因發(fā)揮了作用，導(dǎo)致目的基因在表達(dá)水平上發(fā)生改變，產(chǎn)生了突變效應(yīng)。

2.3.4 ?突變植株花粉活力鑒定 ?有活力花粉數(shù)量和花粉活力是鑒定育性最直接的指標(biāo)，突變植株花粉數(shù)量和花粉活力鑒定結(jié)果顯示（表3，圖9），每視野下突變株花藥中有活力花粉數(shù)量極顯著低于野生型，說(shuō)明Ntms1基因具有控制煙草育性的作用;由圖9看出，突變株花粉粒染色后顏色均呈淡黃色，較野生型花粉粒顏色淺，表明突變株中有活力花粉粒的數(shù)量較野生型低。

3 ?討 ?論

雜種優(yōu)勢(shì)是生物界的一種普遍現(xiàn)象，也是提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要育種途徑，水稻和玉米雜交種的大面積利用對(duì)我國(guó)乃至世界糧食增產(chǎn)和安全作出了巨大貢獻(xiàn)[16]。生產(chǎn)上要使用雜交種，就必須年年制種，制種過(guò)程中人工去雄不僅浪費(fèi)人力，且容易因去雄不徹底導(dǎo)致種子不純，影響生產(chǎn)[15]。利用雄性不育系制種，可以省去人工去雄環(huán)節(jié)，既降低種子生產(chǎn)成本，又提高制種質(zhì)量，因此，不育系的選育對(duì)作物雜種優(yōu)勢(shì)研究利用極為重要。

利用生物信息學(xué)方法對(duì)基因序列進(jìn)行分析，可以發(fā)掘基因信息，預(yù)測(cè)基因的生物學(xué)功能，提高基因功能鑒定的效率[16]。在煙草基因組中，生物信息學(xué)分析能夠進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建、轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)分析等[17]。周輝[18]等利用生物信息學(xué)方法分析了大腸桿菌HspQ基因;張長(zhǎng)靜[20]等運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析了煙草雄性不育系及保持系的sdh3、sdh4基因在其核苷酸、編碼蛋白各結(jié)構(gòu)層次上存在的差異。辣椒與煙草同為茄科作物，基因可能具有一定的相似性，本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)Ntms1基因編碼蛋白質(zhì)序列的理化性質(zhì)、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域、親疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，其結(jié)果為研究Ntms1基因及其編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能提供了更多的信息。

基因編輯技術(shù)是一種能精確修飾生物體基因組特定目標(biāo)基因的一種基因工程技術(shù)，其中基因敲除是鑒定基因功能最直接的方法[20-21]。常愛(ài)霞等[22]通過(guò)構(gòu)建重組載體轉(zhuǎn)化煙草得到早花植株;在對(duì)Cams1基因的研究中，KYUMI等[12]表明，Cams1基因具有控制花粉育性的功能，具體表現(xiàn)為與可育植株相比，不育辣椒植株花粉量明顯降低;而在對(duì)辣椒核不育基因的研究中，DASKALOFF等[23]也發(fā)現(xiàn)了不育植株中花粉敗育的現(xiàn)象。本研究構(gòu)建ms1基因敲除載體后進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，陽(yáng)性植株的基因表達(dá)量及有活力花粉數(shù)均極顯著低于野生型植株，與前人在辣椒上的研究結(jié)果一致，進(jìn)一步說(shuō)明煙草上ms1基因同樣具有控制育性的功能。通過(guò)進(jìn)一步對(duì)本研究獲得的部分不育植株的自交篩選，育成煙草新不育系，可能對(duì)拓寬煙草制種的不育性來(lái)源有非常重要的實(shí)踐意義。

4 ?結(jié) ?論

本研究采用生物信息學(xué)分析方法，以辣椒不育基因Cams1為模板，在煙草品種K326中克隆出序列Ntms1，結(jié)果表明Cams1和Ntms1基因編碼產(chǎn)物具有相似的結(jié)構(gòu)，由此預(yù)測(cè)Ntms1與辣椒不育基因Cams1具有相似的控制育性功能。通過(guò)基因編輯技術(shù)，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將辣椒ms1基因轉(zhuǎn)入烤煙品種K326后獲得了6株陽(yáng)性突變植株。與野生型對(duì)照植株比較，突變株ms1基因表達(dá)量極顯著降低，有活力花粉數(shù)極顯著低于野生型植株，最終獲得了部分不育植株，對(duì)于促進(jìn)煙草雄性不育性的研究有較為重要的科學(xué)意義和實(shí)踐價(jià)值。

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基金項(xiàng)目：貴州省高層次創(chuàng)新型人才培養(yǎng)計(jì)劃——百層次人才{黔科合平臺(tái)人才[2016]5663號(hào)};貴州省煙草公司重大專項(xiàng)“優(yōu)質(zhì)烤煙品種選育關(guān)鍵技術(shù)研究與品種選育”（黔煙科201602）;貴州省煙草公司遵義市公司項(xiàng)目“遵義煙區(qū)烤煙品種篩選布局與后備品種選育研究”{遵煙計(jì)[2016]07號(hào)}

作者簡(jiǎn)介：趙婷婷（1996-），女，在讀碩士研究生，研究方向：作物遺傳育種。E-mail：ttzhao5153@qq.com。*通信作者，E-mail：rxliu@gzu.edu.cn

收稿日期：2019-09-06 ? ? ? ? ? ? ? ?修回日期：2019-12-16