丁永亮 陳仁霄 苑舉民 管成偉 何寬信 張興偉 李卓 張啟明

摘 ?要：為準(zhǔn)確評(píng)價(jià)部分煙草種質(zhì)資源的遺傳多樣性，利用42對(duì)已發(fā)表多態(tài)性較好的煙草SSR標(biāo)記引物對(duì)38份烤煙種質(zhì)資源進(jìn)行分析，篩選出22對(duì)引物在這些種質(zhì)間存在多態(tài)性，平均等位位點(diǎn)數(shù)為3.68個(gè)，Neis多樣性指數(shù)平均為0.451，Shannon信息指數(shù)平均達(dá)0.789。UPGMA聚類(lèi)分析表明，紅花大金元有明顯特異性。遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示，參試材料可分為2個(gè)類(lèi)群，類(lèi)群1和類(lèi)群2分別包含16份和22份種質(zhì)材料，且類(lèi)群1變異范圍大于類(lèi)群2，類(lèi)群2材料多表現(xiàn)為自然株高在210 cm以下，葉數(shù)20～25，莖圍10～11 cm，田間赤星病較嚴(yán)重，青枯病發(fā)病相對(duì)較輕。研究結(jié)果為提升SSR分子標(biāo)記篩選效率和部分烤煙種質(zhì)創(chuàng)新應(yīng)用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：煙草;種質(zhì)資源;SSR分子標(biāo)記;遺傳多樣性;遺傳結(jié)構(gòu)

Genetic Diversity of Flue-cured Tobacco Germplasm Resources Based on SSR Molecular Markers

DING Yongliang1， CHEN Renxiao1， YUAN Jumin1， GUAN Chengwei1， HE Kuanxin1，

ZHANG Xingwei2， LI Zhuo1， ZHANG Qiming1*

（1. Tobacco Science Institute of Jiangxi Province， Nanchang 330009， China; 2. Institute of Tobacco Research of CAAS， Qingdao 266101， China）

Abstract： In order to accurately evaluate the genetic diversity of introduced tobacco germplasm resources， 38 tobacco germplasm resources were analyzed with 42 SSR primers with good polymorphism. A total of 22 pairs of polymorphic primers were selected based on higher identification ability. The average number of alleles was 3.68. The average diversity index of Nei was 0.451， and the average Shannon information index was 0.789. The UPGMA cluster analysis showed the specificity of Honghuadajinyuan. The genetic structure analysis showed that these 38 accessions were classified into two groups （group 1 and group 2）， which included 16 and 22 accessions， respectively. The range of variation of group 1 was larger than that of group 2. Most accessions in group 2 showed less than 210 cm in plant height， more than 20 in the number of leaves， 10-11 cm in the stem circumference. Furmore，the accessions in group 2 were susceptible to brown spot disease but resistant to bacterial wilt. The results can provide theoretical basis for improving SSR molecular marker screening efficiency and innovative utilization of some flue-cured tobacco germplasm.

Keywords： tobacco; germplasm resources; SSR molecular marker; genetic diversity; genetic structure

煙草是我國(guó)重要經(jīng)濟(jì)作物，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。優(yōu)質(zhì)煙葉是卷煙工業(yè)的重要原料，而品種是彰顯煙葉質(zhì)量特色的關(guān)鍵因素之一，對(duì)煙葉品質(zhì)起主導(dǎo)作用[1]。種質(zhì)資源是選育優(yōu)良煙草品種的重要基礎(chǔ)[2]，烤煙遺傳背景狹窄是煙草育種發(fā)展中的突出問(wèn)題[3-4]。因此，建立遺傳資源豐富的種質(zhì)庫(kù)尤為重要。分子標(biāo)記技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于煙草的遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究，而且在煙草化學(xué)成分、普通農(nóng)藝性狀和抗病性等性狀連鎖基因定位中也取得了一定進(jìn)展[5]。在基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記方法中，SSR（Simple Sequence Repeats）標(biāo)記具有多態(tài)性高、操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好等諸多優(yōu)點(diǎn)，在許多作物的遺傳多樣性研究中廣泛應(yīng)用[6]。對(duì)于煙草，BINDLER等[7-8]首次報(bào)道了其SSR標(biāo)記，構(gòu)建了包括2317個(gè)SSR標(biāo)記和2363個(gè)位點(diǎn)，并覆蓋24個(gè)連鎖群的高密度遺傳圖譜，總遺傳長(zhǎng)度為3267 cM，標(biāo)記間的平均距離小于1.5 cM。此后，SSR分子標(biāo)記在煙草種質(zhì)間遺傳多樣性研究中大量應(yīng)用。葉蘭欽等[9]利用92對(duì)煙草SSR標(biāo)記分析了云南省13個(gè)煙草主栽品種的遺傳多樣性，檢測(cè)到20對(duì)SSR多態(tài)性引物。陳夏曄等[10]從960對(duì)引物中篩選出34對(duì)SSR多態(tài)性引物，分析73份煙草抗黑脛病種質(zhì)，認(rèn)為其遺傳背景較狹窄。尹國(guó)英等[6]從278對(duì)引物中篩選出32對(duì)多態(tài)性較好的SSR引物并對(duì)140份煙草種質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明晾曬煙具有豐富的遺傳多樣性。本研究直接利用前人研究中多態(tài)性較高的SSR分子標(biāo)記，對(duì)江西省自存和引進(jìn)的烤煙種質(zhì)資源開(kāi)展遺傳多樣性分析，旨在為煙草新品種的創(chuàng)育和分子標(biāo)記輔助育種提供理論指導(dǎo)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用烤煙種質(zhì)資源共計(jì)38份（表1），其中18份由國(guó)家農(nóng)作物種質(zhì)資源平臺(tái)煙草種質(zhì)資源子平臺(tái)提供;4份為江西省內(nèi)自育品系和收集的突變體，其余均從國(guó)內(nèi)各省引進(jìn)。

1.2 ?試驗(yàn)地點(diǎn)和方法

1.2.1 ?試驗(yàn)地點(diǎn) ?所有材料于2018年3月10日移栽到江西省煙草科學(xué)研究所樂(lè)安試驗(yàn)田內(nèi)，土壤為

砂壤土，無(wú)嚴(yán)重病蟲(chóng)害發(fā)生。土壤肥力狀況：pH值5.3，有機(jī)質(zhì)含量19.1 g/kg，速效氮含量90.3 mg/kg，速效磷含量24.5 mg/kg，速效鉀含量99.5 mg/kg，氯離子含量0.12 mg/kg。

1.2.2 ?農(nóng)藝性狀及病害調(diào)查 ?采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每份材料種植40株，設(shè)3次重復(fù)，行株距1.20 m×

0.50 m，田間管理和調(diào)制按照當(dāng)?shù)亟y(tǒng)一模式進(jìn)行。按照YC/T 142—2010煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查測(cè)量方法調(diào)查各種質(zhì)單株著生葉數(shù)、自然株高、莖圍和節(jié)距等農(nóng)藝性狀，每個(gè)小區(qū)調(diào)查10株。赤星病和青枯病參照GB/T 23222—2008煙草病蟲(chóng)害分級(jí)及調(diào)查方法進(jìn)行調(diào)查，其中赤星病每個(gè)小區(qū)調(diào)查50片葉，青枯病調(diào)查全部煙株。

1.2.3 ?煙草DNA提取 ?以每份種質(zhì)嫩葉為材料，利用磁珠法植物DNA提取試劑盒KFR-804496（Thermo Fisher公司）提取總DNA，用超微量分光光度計(jì)NANODROP 2000（Thermo Fisher公司）檢測(cè)DNA濃度和純度，將其稀釋至約50 ng/μL，?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 ?PCR擴(kuò)增與檢測(cè) ?采用已發(fā)表多態(tài)性較好的42對(duì)煙草SSR標(biāo)記引物[6，11-15]，引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系參照Ex Taq試劑盒（購(gòu)自TAKARA公司）說(shuō)明配制。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，PCR擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，每循環(huán)94 ℃變性30 s，55 ℃（視引物而變）退火30 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸10 min。利用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，在180 V恒壓下電泳3 h，用銀染法顯影。

1.2.5 ?數(shù)據(jù)處理 ?利用Excel 2013軟件統(tǒng)計(jì)農(nóng)藝性狀和病害病情指數(shù)。對(duì)于SSR帶型，在相同遷移率的位置上，有帶記錄為“1”，無(wú)帶記錄為“0”。利用Dataformater軟件對(duì)0、1矩陣進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換，并過(guò)濾無(wú)多態(tài)位點(diǎn)。利用Popgene軟件計(jì)算基因多樣性和Shannon信息指數(shù)。利用NTSYS-pc 2.10軟件構(gòu)建UPGMA（非加權(quán)組平均法）聚類(lèi)圖，并利用DCENTER和EIGEN模塊對(duì)供試煙草材料進(jìn)行主成分分析（PCA）。利用Structure 2.3軟件對(duì)煙草材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，潛在的分組數(shù)值K的范圍設(shè)置在1～10。根據(jù)原始結(jié)果，每一個(gè)K值將獨(dú)立運(yùn)行10次再取平均值，其中burn-in period 10 000 步，MCMC重復(fù)100 000，ΔK參考EVANNO等[16]的算法用來(lái)決定最佳組群數(shù)量。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?SSR引物多態(tài)性分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)10%非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)結(jié)果表明，篩選的42對(duì)SSR標(biāo)記中有27對(duì)檢測(cè)出等位變異。利用Dataformater軟件對(duì)0、1矩陣進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換，并過(guò)濾無(wú)多態(tài)位點(diǎn)，篩選出22對(duì)具有多態(tài)位點(diǎn)的SSR標(biāo)記（表2）。觀測(cè)等位基因數(shù)變幅在2～5之間，平均為3.68個(gè)。有效等位基因數(shù)變幅在1.174～2.885之間，平均為1.94個(gè)，Shannon信息指數(shù)平均為0.789，Neis多樣性指數(shù)變幅在0.148～0.653之間，平均為0.451，其中PT20213多樣性指數(shù)最高，表明具有較高的鑒別能力（圖1）。

2.2 ?種質(zhì)資源聚類(lèi)分析

為確定38份種質(zhì)材料在基因組上的遺傳關(guān)系，利用NTSYS軟件按UPGMA方法進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建了參試材料的親緣關(guān)系圖。由圖2可知，22對(duì)多態(tài)性引物可將36份種質(zhì)材料區(qū)分歸類(lèi)，聚類(lèi)結(jié)果與已知種質(zhì)親緣關(guān)系大致相近，美國(guó)引進(jìn)種質(zhì)和部分突變體材料遺傳距離較近，國(guó)內(nèi)各種質(zhì)間距離較近。利用DCENTER和EIGEN對(duì)供試材料進(jìn)行主成分分析（圖3），結(jié)果表明，38份種質(zhì)材料大致可分為2個(gè)類(lèi)群，且兩個(gè)類(lèi)群的離散程度存在較大差異。

2.3 ?群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

利用Structure軟件對(duì)煙草種質(zhì)材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析（圖4）得出，群體等位變異頻率特征類(lèi)型數(shù)K呈逐漸增大的趨勢(shì)，通過(guò)EVANNO等[16]ΔK值來(lái)確定K值。ΔK值在K=2時(shí)值最大，表明等位變異頻率特征類(lèi)型數(shù)K=2時(shí)其模型后驗(yàn)概率最大，由此可將38份種質(zhì)材料分為2個(gè)類(lèi)群。煙草38個(gè)種質(zhì)材料的群體遺傳結(jié)構(gòu)如圖5，其中類(lèi)群1（POP 1）包括G80、K326、Coker86、CV70、CV87、中煙98、中煙102、云煙97、云煙99、云煙110、HY06、粵煙98、FJ109、閩煙9號(hào)、紅花大金元、新豐變等16個(gè)種質(zhì)材料，類(lèi)群2（POP2）包括剩余的22份種質(zhì)材料。遺傳結(jié)構(gòu)分析與聚類(lèi)分析在云煙110、云煙97和Coker86等材料的群體劃分結(jié)果上存在差異，與主成分分析在云煙110、NC2514、豫煙10號(hào)等材料的群體劃分結(jié)果上存在差異。

2.4 ?兩個(gè)遺傳群體農(nóng)藝性狀與抗病性變異分析

如圖6所示，群體遺傳結(jié)構(gòu)分析所得兩個(gè)群體的農(nóng)藝性狀和田間主要病害發(fā)病情況存在差異。POP1在各農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)范圍內(nèi)均有分布，POP2自然株高均在210 cm以下，99.91%的種質(zhì)材料自然株高不超過(guò)185 cm，著生葉片17.6片以上，莖圍在10.1～11.0 cm范圍內(nèi)種質(zhì)數(shù)占比高達(dá)86.36%，節(jié)距集中在3.6～4.9 cm。在赤星病方面，POP1有12.5%的個(gè)體發(fā)病指數(shù)在10以內(nèi)，POP2發(fā)病指數(shù)均在10.1以上。在青枯病方面，兩個(gè)類(lèi)群病情指數(shù)主要處于0～5.0之間，POP1和POP2在此范圍內(nèi)的株數(shù)分別占比56.25%和81.82%，其中POP2發(fā)病指數(shù)均在15.0以下。由此可見(jiàn)，POP1的農(nóng)藝性狀變異范圍大于POP2，POP2材料多表現(xiàn)為株高在210 cm以下，葉片數(shù)20～25，莖圍10～11 cm，田間赤星病較嚴(yán)重，青枯病發(fā)病相對(duì)較輕。

3 ?討 ?論

篩選出多態(tài)性較好的SSR分子標(biāo)記是開(kāi)展煙草SSR相關(guān)研究的基礎(chǔ)。張銘真等[17]從250對(duì)引物中篩選出64對(duì)SSR引物，分析了81份煙草種質(zhì)資源的遺傳多樣性，平均等位位點(diǎn)數(shù)為4.2個(gè)。馬冰等[18]從2317對(duì)引物中篩選出24對(duì)核心引物對(duì)20份烤煙種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，平均等位位點(diǎn)數(shù)為3.54個(gè)。鞠馥竹等[19]從580對(duì)引物中篩選出43對(duì)多態(tài)性引物，平均等位位點(diǎn)數(shù)為3.39個(gè)。為充分利用前人研究成果，本研究利用42對(duì)已發(fā)表的多態(tài)性較好的SSR標(biāo)記引物對(duì)38份煙草種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，篩選到22對(duì)引物在這些種質(zhì)間存在多態(tài)性，檢測(cè)到81條多態(tài)性擴(kuò)增條帶，平均等位位點(diǎn)數(shù)為3.68個(gè)，與前人研究相當(dāng)，但較大程度減少了標(biāo)記篩選工作量，提升了效率。Neis多樣性指數(shù)平均為0.451，Shannon信息指數(shù)平均達(dá)0.789，說(shuō)明這些引物總體上有較好的鑒別能力，種質(zhì)材料具有較高的遺傳多樣性。

本研究所用種質(zhì)材料包括國(guó)外引進(jìn)種質(zhì)、國(guó)內(nèi)地方種質(zhì)和本省自有突變體等，聚類(lèi)分析和主成分分析發(fā)現(xiàn)紅花大金元與大部分種質(zhì)材料遺傳距離大，可以考慮將其作為親本材料拓寬遺傳背景，發(fā)掘優(yōu)異性狀。聚類(lèi)及遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示美國(guó)引進(jìn)的種質(zhì)材料遺傳距離近，遺傳背景相似，與MOON等[20]研究結(jié)果相一致。聚類(lèi)分析未能將參試的38份種質(zhì)材料劃分成明顯的類(lèi)群，主成分分析初步顯示38份材料可劃分為2個(gè)類(lèi)群，與類(lèi)群2相比，類(lèi)群1種質(zhì)間變異和離散程度更大，這與類(lèi)群遺傳結(jié)構(gòu)分析的類(lèi)群間農(nóng)藝性狀及抗病性變異分析相一致。但是兩個(gè)分類(lèi)結(jié)果在云煙110、云煙97和Coker86 3個(gè)材料的類(lèi)群劃分上存在差異，造成這種差異的主要原因是兩者分類(lèi)依據(jù)不同。聚類(lèi)分析依據(jù)的是烤煙材料間的遺傳距離，反映其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近;而群體遺傳結(jié)構(gòu)分類(lèi)依據(jù)服從Hardy-Weinberg平衡的群體數(shù)目，基于數(shù)學(xué)模型之上，并計(jì)算各供試材料間相應(yīng)的Q值[21]。因此，本試驗(yàn)利用Structure軟件將供試烤煙材料分為2個(gè)類(lèi)群，具有較高的準(zhǔn)確性。此外，關(guān)聯(lián)分析已廣泛應(yīng)用于大麥[22]、玉米[23]、小麥[24]、水稻[25]、花生[26]等作物的遺傳育種研究，煙草與農(nóng)藝性狀[21]、抗病性[27]、致香物質(zhì)[28]等方面的關(guān)聯(lián)分析也大量出現(xiàn)，本研究可進(jìn)一步在農(nóng)藝性狀、抗病性、化學(xué)成分等方面開(kāi)展多年重復(fù)試驗(yàn)，尋找與性狀緊密相關(guān)的標(biāo)記，以用于分子標(biāo)記輔助育種研究。

4 ?結(jié) ?論

利用已發(fā)表多態(tài)性較好的42對(duì)煙草SSR標(biāo)記引物對(duì)38份煙草種質(zhì)材料進(jìn)行分析，篩選到22對(duì)引物在這些種質(zhì)間存在多態(tài)性，平均等位位點(diǎn)數(shù)為3.68個(gè)。參試的38份煙草種質(zhì)具有較高的遺傳多樣性，UPGMA聚類(lèi)分析顯示紅花大金元具有明顯特異性。遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示，參試材料可分為2個(gè)類(lèi)群，在農(nóng)藝性狀和抗病性方面，類(lèi)群1變異范圍大于類(lèi)群2，類(lèi)群2材料多表現(xiàn)為株高在210 cm以下，葉數(shù)20～25，莖圍10～11 cm，田間赤星病較嚴(yán)重，青枯病發(fā)病相對(duì)較輕。本研究結(jié)果為提升SSR分子標(biāo)記篩選效率和部分烤煙種質(zhì)創(chuàng)新應(yīng)用提供理論依據(jù)，并為進(jìn)一步與農(nóng)藝性狀、抗病性、化學(xué)成分等方面開(kāi)展關(guān)聯(lián)分析奠定了基礎(chǔ)。

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基金項(xiàng)目：江西省煙草公司科技項(xiàng)目“煙草種質(zhì)資源的收集引進(jìn)與種質(zhì)庫(kù)建立”（201401001）

作者簡(jiǎn)介：丁永亮（1990-），男，農(nóng)藝師，碩士，從事煙草育種及生物技術(shù)研究。E-mail：yld9001@163.com

*通信作者，E-mail：zhangqiming1979@163.com

收稿日期：2019-10-23 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 修回日期：2020-02-14