王宗成 路大中 王守敏 鄭輝煌 楊麗華 羅小芳

(湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院1，永州 425199) (湖南科技學(xué)院湖南省生物質(zhì)資源綜合開(kāi)發(fā)利用工程技術(shù)研究中心2，永州 425199)

油茶為我國(guó)特有的木本油料樹(shù)種，是世界四大木本油料植物之一[1]，同時(shí)也是我國(guó)四大木本油料植物之一[2]。山茶油為油茶果實(shí)中通過(guò)壓榨或浸出得到，其含有油酸、亞油酸、生育酚等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有預(yù)防心血管疾病和降低膽固醇的作用[3-5]。

原花青素是一類黃烷醇單體及其聚合體的多酚化合物，也稱縮合單寧。原花青素具有護(hù)肝降脂、防治動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化等藥理學(xué)活性[6-8]。同時(shí)原花青素具有抗紫外線作用，常用在防曬護(hù)膚品中，被西方稱為“口服化妝品”和“皮膚維生素”[9,10]。

目前山茶油的研究主要集中在維生素E、角鯊烯和植物甾醇含量的測(cè)定等方面，對(duì)其原花青素含量極少報(bào)道[11,12]。原花青素能夠清除自由基，明顯增強(qiáng)油脂的抗氧化性，因此測(cè)定油脂中原花青素含量對(duì)油脂抗氧化性研究具有指導(dǎo)意義[13]。原花青素含量測(cè)定方法有高效液相色譜法[14]、香草醛-鹽酸法和香草醛-硫酸法[15]等方法。高效液相色譜法具有測(cè)量精度高、穩(wěn)定性高和重復(fù)性好，但原料原花青素采用純甲醇提取，而原花青素更易溶于甲醇水溶液中[16]。香草醛-鹽酸法和香草醛-硫酸法弄夠用來(lái)測(cè)定原花青素，但香草醛在濃酸作用下也能與五環(huán)三萜類化合物作用形成絡(luò)合物影響測(cè)定結(jié)果[17]。

本研究在高效液相色譜法基礎(chǔ)上研究適合山茶油的原花青素提取及含量測(cè)定方法，以期為山茶油的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山茶油：冷榨冷提工藝，產(chǎn)地為湖南衡陽(yáng)；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品：UV≥95%；甲醇、磷酸：色譜純；其他試劑均為分析純，水為蒸餾水。

AUW120型電子天平;UV-1750型紫外分光光度計(jì);HH-6型恒溫水浴鍋;Agilent 1260型高效液相色譜儀。

1.2 方法

1.2.1 山茶油中原花青素提取

稱取15 g樣品于燒瓶中(精確到0.000 1 g)，加入20 mL一定濃度甲醇溶液，在一定溫度下攪拌，冷凝回流萃取一定時(shí)間，離心，收集上清液(一次提取)，用相同甲醇溶液定容到100 mL，待測(cè)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

將原花青素標(biāo)準(zhǔn)樣品用50%甲醇溶液溶解，并制備60、80、100、120、140 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液，吸取1 mL各標(biāo)準(zhǔn)梯度溶液分別置于不同的磨口錐形瓶中，加熱真空揮干，分別加入15 mL正丁醇與鹽酸的混合液(正丁醇∶鹽酸=95∶5)，再加入0.2 mL 2%硫酸鐵銨溶液(用濃度2 mmol/L鹽酸配成2%的溶液)，混勻，置沸水浴回流，加熱40 min后，立即至冰水浴冷卻2 min，取出后放置室溫10 min，于波長(zhǎng)545 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)(A)，原花青素標(biāo)準(zhǔn)梯度濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 方法學(xué)考察

1.2.3.1 精密度試驗(yàn)

取1 mL濃度為80 μg/mL的原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線相同條件下進(jìn)行操作測(cè)定吸光度，平行6份，計(jì)算RSD值。

1.2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

分別吸取3 mL樣品待測(cè)液置于6個(gè)不同的磨口錐形瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線相同條件下進(jìn)行操作測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD值。

1.2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

吸取3 mL樣品待測(cè)液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線相同條件下進(jìn)行操作，每10 min測(cè)定一次吸光度，考察1 h內(nèi)吸光度的穩(wěn)定性，計(jì)算RSD值。

1.2.3.4 加樣回收率試驗(yàn)

取6份3 mL已知含量的樣品提取液，加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液混勻，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線相同條件下進(jìn)行操作測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率和RSD值。

1.2.4 幾種測(cè)定方法比較

方法一：取3 mL樣品待測(cè)液按照標(biāo)準(zhǔn)曲線相同條件下進(jìn)行操作測(cè)定山茶油中原花青素含量。

方法二：取樣品待測(cè)液參照文獻(xiàn)方法[13]進(jìn)行高效液相色譜法測(cè)定山茶油中原花青素含量。

方法三：稱取0.5 g油脂(精確至0.000 1 g)，用純甲醇定容至50 mL容量瓶中，移取2mL溶液參照文獻(xiàn)方法[13]進(jìn)行高效液相色譜法測(cè)定山茶油中原花青素含量。

方法四：稱取0.5 g油脂(精確至0.000 1 g)，加入15 mL正丁醇與鹽酸的混合液(正丁醇 ∶鹽酸=95∶5)，再加入0.2 mL 2%硫酸鐵銨溶液(用濃度2 mmol/L鹽酸配成2%的溶液)，混勻，置沸水浴回流，加熱40 min后，立即至冰水浴冷卻2 min，取出后放置室溫10 min，于波長(zhǎng)545 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.5 單因素試驗(yàn)

1.2.5.1 甲醇溶液濃度的選擇

采用提取溫度為70 ℃、提取時(shí)間為40 min、提取次數(shù)2次，分別考察甲醇體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%條件下對(duì)原花青素含量的影響。

1.2.5.2 水浴溫度的選擇

采用甲醇體積分?jǐn)?shù)為50%、提取時(shí)間為40 min、提取次數(shù)2次，分別考察水浴溫度60、70、80、90、100 ℃條件下條件下對(duì)原花青素含量的影響。

1.2.5.3 提取時(shí)間的選擇

采用甲醇體積分?jǐn)?shù)為50%、水浴溫度為70 ℃、提取次數(shù)2次，分別考察提取時(shí)間20、30、40、50、60 min條件下對(duì)原花青素含量的影響。

1.2.5.4 提取次數(shù)的選擇

采用甲醇體積分?jǐn)?shù)為50%、水浴溫度為70 ℃、提取時(shí)間為40 min，分別考察提取次數(shù)1、2、3、4、5 次條件下對(duì)原花青素含量的影響。

1.2.6 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，確定出山茶油中原花青素提取的最佳工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

按照1.2.2方法可得，原花青素標(biāo)準(zhǔn)樣品的回歸方程為A=0.004 3x+0.004 5(R2=0.999 4)。其濃度在60～140 μg范圍內(nèi)線性良好。原花青素標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗(yàn)

精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，精密度試驗(yàn)RSD值為1.23%，表明儀器精密度良好。

2.2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，重復(fù)性試驗(yàn)RSD值為2.43%，表明重復(fù)性良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD值為1.25%，表明待測(cè)樣品在1 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 加樣回收率試驗(yàn)

加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，加樣回收率試驗(yàn)平均加樣回收率為100.18%，RSD值為1.41%，加樣回收率范圍98.70%～102.15%，表明該方法具有良好的加樣回收率。

2.3 幾種測(cè)定方法比較

幾種測(cè)定方法比較見(jiàn)表5。

表5 幾種測(cè)定方法比較

由表5可知，方法四比色液渾濁，直接導(dǎo)致原花青素含量結(jié)果嚴(yán)重偏高；方法二和方法三原花青素含量結(jié)果對(duì)比表明原花青素更易溶于甲醇溶液，因此用甲醇溶液提取更為準(zhǔn)確；方法一和方法二原花青素含量結(jié)果非常接近，說(shuō)明兩種方法都適用于山茶油中原花青素含量的測(cè)定，為操作快速、方便，選擇方法一。由方法一、方法二、方法三的原花青素含量結(jié)果與方法四的原花青素含量結(jié)果比較可知，甲醇溶液從山茶油中提取原花青素后測(cè)得的結(jié)果更為準(zhǔn)確，因此準(zhǔn)確測(cè)定山茶油中原花青素含量采用甲醇溶液從山茶油中先提取原花青素再進(jìn)行比色測(cè)定結(jié)果。

2.4 單因素試驗(yàn)

各因素對(duì)原花青素含量影響如圖2所示。

圖2 各因素對(duì)原花青素含量影響

2.4.1 甲醇濃度的選擇

甲醇溶液提取原花青素遵循相似相溶原理，調(diào)節(jié)甲醇體積分?jǐn)?shù)，讓其極性接近原花青素，從而達(dá)到原花青素的最高溶解度。由圖2可知，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)升高，原花青素含量逐漸增加，但甲醇體積分?jǐn)?shù)到達(dá)60%以后，原花青素含量反而減少。因此甲醇體積分?jǐn)?shù)為50%～60%時(shí)提取原花青素效果較好。

2.4.2 水浴溫度的選擇

水浴溫度對(duì)原花青素提取過(guò)程表現(xiàn)為兩個(gè)方面：一方面，傳質(zhì)效率隨著溫度升高而增加；另一方面，溫度過(guò)高，溶解在提取溶液中的雜質(zhì)增加，這些雜質(zhì)使得提取混合液黏度增加，進(jìn)而影響原花青素的提取效率。由圖2可知，原花青素含量隨溫度不斷升高先增加后降低，當(dāng)水浴溫度達(dá)到70～80 ℃時(shí)，原花青素含量達(dá)到最大。因此水浴溫度為70～80 ℃時(shí)，原花青素提取效果較好。

2.4.3 提取時(shí)間的選擇

提取時(shí)間對(duì)原花青素提取過(guò)程的影響主要表現(xiàn)在提取溶劑與油脂混合，油脂中的原花青素溶解到提取溶劑中，直到油脂中原花青素濃度與提取溶劑原花青素濃度一致時(shí)，傳質(zhì)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，而當(dāng)提取時(shí)間不足時(shí)，則原花青素提取不徹底。由圖2可知，原花青素含量隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)先增大后趨于平衡，當(dāng)提取時(shí)間為40 min時(shí)，原花青素含量達(dá)到最大，當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)40 min，原花青素含量不再增加。因此選用提取時(shí)間為40 min。

2.4.4 提取次數(shù)的選擇

提取次數(shù)對(duì)原花青素提取過(guò)程的影響主要表現(xiàn)在不斷降低油脂中原花青素含量，使原花青素幾乎全部溶解到提取溶液中。由圖2可知，原花青素含量隨提取次數(shù)的增加先增大后趨于平衡，當(dāng)提取次數(shù)為3次時(shí)，原花青素含量達(dá)到最大，當(dāng)提取次數(shù)超過(guò)3次，原花青素含量不再增加。因此選用提取次數(shù)為3次。

2.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)甲醇濃度、水浴溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表6中極差分析可知，影響原花青素含量的影響因素主次順序?yàn)椋篈(甲醇體積分?jǐn)?shù))>C(提取時(shí)間)>B(水浴溫度)>D(提取次數(shù))。山茶油中原花青素最佳提取工藝組合為A2B2C2D3，即甲醇體積分?jǐn)?shù)50%、水浴溫度80 ℃、提取時(shí)間40 min、提取次數(shù)4次。

對(duì)正交試驗(yàn)得到的山茶油中原花青素最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由表7可知，在甲醇體積分?jǐn)?shù)50%、水浴溫度80 ℃、提取時(shí)間40 min和提取4 次的提取工藝條件下，測(cè)得山茶油中平均原花青素含量為265.90 mg/Kg(RSD值為1.11%，說(shuō)明重復(fù)性好)。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法優(yōu)化山茶油中原花青素的提取，影響原花青素含量的影響因素從大到小依次為：甲醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)。

山茶油中原花青素最佳提取工藝為甲醇體積分?jǐn)?shù)50%、水浴溫度80 ℃、提取時(shí)間40 min、提取4 次；在此條件下所提取得到山茶油中平均原花青素含量為265.90 mg/kg。

山茶油中原花青素的提取優(yōu)化工藝穩(wěn)定可行，且原花青素含量測(cè)定方法可靠。