趙二勞 展俊嶺 楊 潔 趙三虎

(忻州師范學(xué)院化學(xué)系， 忻州 034000)

黃芥籽為十字花科蕓薹屬植物芥菜型油菜黃芥(BrassicajunceaL.)的籽粒，我國主產(chǎn)于晉北、陜北、內(nèi)蒙、甘肅和青海等黃土高原地區(qū)，資源豐富[1]。黃芥籽顆粒較小，千粒質(zhì)量2.0～2.6 g，畝產(chǎn)可達100～150 kg，種植效益較好。其皮殼為黃色或棕黃至棕紅色，具有皮薄、色素少、含油量高以及纖維素含量低等優(yōu)點[2-3]。目前，黃芥籽主要用于榨油，榨油后產(chǎn)生大量的副產(chǎn)品黃芥籽粕，多用作農(nóng)肥或飼料，未進行精深加工，科技附加值低下，利用效益不高，造成資源的極大浪費。黃芥籽粕含有多糖、多酚及黃酮等功能活性成分，具有多種功能活性，在食品、醫(yī)藥、保健品等領(lǐng)域應(yīng)用前景較好[4-7]。因此，研究黃芥籽粕中多糖、多酚及黃酮等功能成分的提取及其生物活性，對于提高黃芥籽粕科技附加值，有效拉長黃芥產(chǎn)業(yè)鏈，促進黃芥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，提升黃芥籽綜合利用效益和經(jīng)濟價值，具有重要的實際意義。

目前，本課題組已就黃芥籽粕中多糖和多酚的提取及其一些功能活性進行了研究[1,8]，但有關(guān)黃芥籽粕中黃酮的提取鮮見相關(guān)研究報道。同時基于超聲輔助提取技術(shù)的優(yōu)勢[9-10]，本實驗研究黃芥籽粕中黃酮的超聲輔助提取，通過單因素實驗結(jié)合響應(yīng)面分析的方法優(yōu)化提取工藝，并采用清除DPPH·和·OH法測定其抗氧化活性，以期為黃芥籽粕中黃酮的提取及黃芥籽粕的高值化綜合開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黃芥籽粕(粉碎過40目篩，經(jīng)石油醚脫脂后，烘干，保存?zhèn)溆?；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH·)、2,6-二叔丁基對甲酚 (BHT)、無水乙醇、水楊酸、30%過氧化氫、硫酸亞鐵、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等試劑均為分析純；實驗用水為二次去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

723型可見分光光度計；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器；SHZ-2D循環(huán)水式真空泵。

1.3 方法

1.3.1 黃芥籽粕黃酮的超聲輔助提取

工藝流程：預(yù)處理后黃芥籽粕粉→加入乙醇→超聲輔助提取→過濾→濾液定容→提取液。

主要工藝參數(shù)：預(yù)處理后黃芥籽粕粉2.0 g，提取次數(shù)1次，過濾后提取液均定容為100 mL，其余工藝參數(shù)按實驗設(shè)計。

1.3.2 黃芥籽粕中黃酮得率的測定1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定[11-12]。在最大波長510 nm處測定不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度，以蘆丁質(zhì)量濃度(C，μg/mL)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：A= 0.011 9C+0.003，R2=0.999 5，蘆丁質(zhì)量濃度C的線性范圍為0～72μg/mL。

1.3.2.2 黃芥籽粕黃酮提取得率的測定

準(zhǔn)確量取黃芥籽粕提取液3.0 mL，置于25 mL比色管中，按1.3.2.1的方法測定并計算提取液中黃酮質(zhì)量，按公式計算黃芥籽粕黃酮提取得率。

黃芥籽粕黃酮得率 = 提取黃酮質(zhì)量(mg)/黃芥籽粕質(zhì)量(g)

1.3.3 黃芥籽粕黃酮抗氧化活性

以清除DPPH·和·OH的IC50值為指標(biāo)，用抗氧化劑2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)為陽性對照，評價黃芥籽粕黃酮的抗氧化活性，IC50值越小，則其抗氧化活性越強。

1.3.3.1 黃芥籽粕黃酮對DPPH·的清除率

參考文獻[1,13]的方法稍作改動，準(zhǔn)確量取6份1.0 mL質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的DPPH·溶液(無水乙醇配制)，分別置于10 mL比色管中，分別加入不同質(zhì)量濃度的黃芥籽粕黃酮提取液，以體積分數(shù)70%乙醇定容至刻度，充分搖勻，在室溫下，避光反應(yīng)30 min后，在波長517 nm 處分別測定其吸光度，按公式計算清除率。

清除率= [1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A1為DPPH·溶液與一定黃芥籽粕黃酮溶液的吸光度；A2為僅黃芥籽粕黃酮溶液體系的吸光度，A0為僅DPPH·溶液體系的吸光度。

同法測定并計算BHT溶液的清除率。然后分別作黃芥籽粕黃酮和BHT溶液對DPPH·清除率曲線，對曲線線性回歸計算其IC50值，比較其抗氧化活性。

1.3.3.2 黃芥籽粕黃酮對·OH的清除率

參考文獻[1,14]的方法稍作改動， 在10 mL的比色管中，分別加入1.0 mL濃度為1×10-3mol/L的FeSO4溶液、1.0 mL濃度為1×10-3mol/L的水楊酸溶液和1.0 mL濃度為0.1% H2O2溶液，再加入一定濃度的黃芥籽粕黃酮或BHT溶液，用體積分數(shù)70%乙醇定容至刻度， 40 ℃恒溫反應(yīng)40 min后，于最大波長510 nm處測定其吸光度，按公式計算清除率。

清除率= [1-(Ai-Aj)/Ax]×100%

式中：Ax為不加黃芥籽粕黃酮或BHT溶液體系的吸光度；Ai加入黃芥籽粕黃酮或BHT溶液體系的吸光度；Aj僅黃芥籽粕黃酮或BHT溶液體系的吸光度。

分別作黃芥籽粕黃酮和BHT溶液對·OH清除率曲線，對曲線線性回歸計算其IC50值，比較其抗氧化活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本實驗所有數(shù)值均為3次重復(fù)實驗的平均值。數(shù)據(jù)間P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

單因素實驗結(jié)果如圖1。由圖1可知，固定超聲功率240 W、提取溫度40 ℃、料液比(g/mL)1∶20、提取時間30 min，當(dāng)乙醇體積分數(shù)分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%時，隨乙醇體積分數(shù)增加，黃芥籽粕中黃酮得率先增大后降低，在乙醇體積分數(shù)為70%時，黃酮得率達到最大值8.89 mg/g，再繼續(xù)增大乙醇體積分數(shù)，黃酮得率下降。其原因可能是乙醇體積分數(shù)過高，會增加黃芥籽粕中其他醇溶性物質(zhì)溶出，影響黃酮類成分的溶出，導(dǎo)致黃芥籽粕黃酮得率降低[11]，因此，選擇乙醇體積分數(shù)為70%。

固定超聲功率240 W、提取溫度40 ℃、乙醇體積分數(shù)為40%、提取時間為30 min，料液比(g/mL)分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30時，隨料液比的增加，黃芥籽粕黃酮得率呈先增加后降低的趨勢。在料液比為1∶15(g/mL)時，黃芥籽粕中黃酮得率達到最大，為9.38 mg/g，之后隨料液比的增加，黃酮得率逐漸減小?？赡茉蚴侨軇┝康脑黾?，有利于黃酮類成分的溶解及增大了溶液的傳質(zhì)推動力，使黃酮得率增加；但料液比繼續(xù)增加，一方面影響超聲波輻射對黃芥籽粕作用的效率[1]，另一方面會增加一些其他成分溶出，影響黃酮類成分溶出[15，16]，導(dǎo)致黃酮得率下降，因此，選擇料液比(g/mL)為1∶15。

固定超聲功率240 W、乙醇體積分數(shù)為40%、料液比(g/mL)1∶20、提取溫度40 ℃，提取時間分別為10、20、30、40、50、60 min時，隨提取時間的增加，黃芥籽粕黃酮得率緩慢增加，當(dāng)提取時間為40 min時，黃酮得率達最大，為7.84 mg/g。以后隨提取時間的增加，黃酮得率下降。其原因可能是提取時間短，黃酮提取不充分；提取時間過長，在超聲波的作用下，會破壞黃酮的結(jié)構(gòu)，使黃酮得率下降[16]。因此，選擇提取時間為40 min。

固定乙醇體積分數(shù)為40%、料液比(g/mL)1∶20、提取溫度40 ℃、提取時間30 min，超聲功率分別為160、200、240、280、320、360 W時，隨超聲功率的增大，黃芥籽粕黃酮得率呈先增后降趨勢，但總體變化不大，在超聲功率為280 W時，黃酮得率達最大，為9.24 mg/g。因此確定超聲功率為280 W。

固定超聲功率240 W、乙醇體積分數(shù)為40%、料液比(g/mL)1∶20，提取時間30 min，提取溫度分別為20、30、40、50、60、70 ℃時，隨提取溫度升高，黃芥籽粕黃酮得率呈先增后降趨勢，當(dāng)提取溫度為30 ℃時，黃芥籽粕黃酮得率達最大，為8.79 mg/g。黃酮得率逐漸下降，但變化不大?？紤]能耗等問題[11]，確定提取溫度為30 ℃。

圖1 超聲輔助提取黃芥籽粕黃酮單因素實驗

2.2 響應(yīng)面實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，固定超聲功率280 W、提取溫度30 ℃，選取對黃芥籽粕黃酮提取得率影響較大的乙醇體積分數(shù)(A)、料液比(B)和提取時間(C)為因素，以黃酮提取得率(Y)為響應(yīng)值，進行三因素三水平的響應(yīng)面分析，確定黃芥籽粕黃酮超聲輔助提取的最佳工藝。因素與水平見表1，響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 因素與水平

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

利用Design Expert 8.0.6 軟件對表2數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到黃芥籽粕黃酮得率對各因素的二次多項回歸方程為：Y=10.09+0.11A+0.18B+0.38C-0.30AB+0.08AC+0.07BC-0.34A2-0.33B2-2.14C2。對該回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸方程的方差分析

注：P<0.01為差異極顯著；P<0.05為差異顯著。

2.3 驗證實驗

通過Design- Expert 8.0.6 軟件對回歸模型分析，得到黃芥籽粕黃酮超聲輔助提取最佳工藝條件為：固定超聲功率280 W、提取溫度為30 ℃時，乙醇體積分數(shù)70.57%，料液比(g/mL)1∶16.28，提取時間40.94 min。此工藝條件下，黃芥籽粕黃酮理論得率為10.134 mg/g。進行驗證實驗考查實驗結(jié)果的可靠性，為了實驗操作便利，將工藝條件修正為：固定超聲功率280 W、提取溫度為30 ℃，乙醇體積分數(shù)為71%，料液比(g/mL)1∶16，提取時間41 min，進行3次平行驗證實驗，黃芥籽粕黃酮平均得率為10.042 mg/g，與理論預(yù)測值的相對誤差為0.91%，表明響應(yīng)面法優(yōu)化的黃芥籽粕黃酮超聲輔助提取工藝穩(wěn)定可靠。

2.4 黃芥籽粕黃酮抗氧化活性

2.4.1 黃芥籽粕黃酮對DPPH·的清除率

黃芥籽粕中黃酮類成分對DPPH·的清除結(jié)果如圖2所示。在濃度范圍內(nèi)，黃芥籽粕黃酮提取液和BHT溶液對DPPH·的清除率都隨其濃度的增加而增大，量效關(guān)系明顯。分別對其清除率曲線進行線性回歸，計算得黃芥籽粕黃酮與BHT清除DPPH·的IC50分別為3.80、6.21 μg/mL，可見，黃芥籽粕黃酮對DPPH·的清除能力強于常用抗氧化劑BHT，表明黃芥籽粕黃酮具有較強的DPPH·清除能力，即具有強的抗氧化活性。

圖2 黃芥籽粕黃酮和BHT對DPPH·的清除率

2.4.2 黃芥籽粕黃酮對·OH的清除率

黃芥籽粕中黃酮類成分對·OH的清除結(jié)果如圖3所示。可以看出，在實驗濃度范圍內(nèi)，黃芥籽粕黃酮提取液和BHT溶液對·OH的清除率都隨其濃度的增加而增大，也具有明顯的量效關(guān)系。分別對其清除率曲線進行線性回歸，計算得黃芥籽粕黃酮與BHT清除·OH的IC50分別為2.18 μg/mL和5.87 μg/mL，顯見，黃芥籽粕黃酮對·OH的清除能力強于常用抗氧化劑BHT，表明黃芥籽粕黃酮具有強的·OH清除能力，即黃芥籽粕黃酮具有較強的抗氧化活性。

圖3 黃芥籽粕黃酮和BHT對·OH的清除率

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化了黃芥籽粕中黃酮超聲輔助提取工藝，并采用清除DPPH·和·OH法測定了黃芥籽粕黃酮抗氧化活性。影響黃芥籽粕黃酮超聲輔助提取得率的因素大小順序為：提取時間>料液比>乙醇體積分數(shù)。確定的黃芥籽粕黃酮超聲輔助提取最佳工藝條件為：乙醇體積分數(shù)71%，料液比(g/mL)1∶16，超聲功率280 W、提取溫度30 ℃，提取時間41 min。在此工藝條件下，黃芥籽粕黃酮得率為10.042 mg/g，與理論預(yù)測值10.134 mg/g的相對誤差為0.91%。黃芥籽粕黃酮與BHT清除DPPH·的IC50分別為3.80 μg/mL和6.21 μg/mL；清除·OH的IC50分別為2.18、5.87 μg/mL。表明響應(yīng)面法優(yōu)化的黃芥籽粕黃酮超聲輔助提取工藝穩(wěn)定可行，黃芥籽粕黃酮具有強的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑開發(fā)應(yīng)用。