肖志剛 陶莉偉 呂春月 王 娜 崔曉彤 張權(quán)峰 楊慶余

(沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院1，沈陽 110034)

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院2，沈陽 110161)

藜麥又稱為南美藜[1]，營養(yǎng)價(jià)值十分豐富，具有抗腫瘤[2]、抗菌、抗氧化[3，4]、增強(qiáng)免疫[5，6]的作用，對糖尿病[7，8]及心血管疾病[9，10]有良好的防治作用。淀粉是藜麥種子的主要成分，約占干物質(zhì)的53.5%～69.2%[11]，藜麥淀粉具有極好的凍融和凝沉穩(wěn)定性，藜麥淀粉可以作為化學(xué)改性淀粉的替代品。阿魏酸是米糠的主要成分之一，具有很強(qiáng)的抗氧化能力和抗紫外線吸收特性[12]，阿魏酸也被認(rèn)為是一種結(jié)腸癌的潛在化學(xué)預(yù)防成分[13]。目前，阿魏酸淀粉酯的合成主要是化學(xué)法[14]，但化學(xué)法中使用的三氯化磷、氯化亞砜等用來活化阿魏酸的?；瘎┒季哂袆《静⑶視?huì)對環(huán)境造成污染，在化學(xué)反應(yīng)過程中還會(huì)發(fā)生副反應(yīng)，導(dǎo)致有害副產(chǎn)物的產(chǎn)生。此外，在使用?；瘎┑耐瑫r(shí)，反應(yīng)過程中需要通入氮?dú)鈦肀ＷC阿魏酸淀粉酯的合成，所以，在操作上比較繁瑣，而且取代度也比較低。

本研究以原藜麥淀粉為原料，異辛烷作為溶劑體系，豬胰脂肪酶和Novozym435脂肪酶為催化劑，通過非水相酶法制備具有抗氧化性的阿魏酸藜麥淀粉酯。利用掃描電子顯微鏡、傅里葉變換紅外光譜儀、X射線衍射儀及差示掃描量熱儀等方法研究阿魏酸藜麥淀粉酯的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化規(guī)律，并揭示其抗氧化特性的變化規(guī)律。該研究為功能性淀粉的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥、阿魏酸(FA)、豬胰脂肪酶、 Novozym435脂肪酶、DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti J高效離心機(jī)；D-max-2 500型X射線衍射儀；DSC-Q20差示掃描量熱儀；RVA-TecMaster快速黏度分析儀；Nicolet 380型傅里葉紅外光譜儀；NHITACHIS-3 400掃描電子顯微鏡。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藜麥淀粉的提取

將藜麥種子粉碎后過100目篩，取篩下物保存?zhèn)溆?。稱取適量藜麥粉100目篩下物并將其與0.2%的NaOH溶液按照1∶5的比例混合，攪拌3 h后，靜置過夜。將混合物于5 000 r/min離心10 min，去除上層黃色蛋白質(zhì)和下層灰色沉淀，取出中間白色淀粉反復(fù)離心、洗滌，用HCl調(diào)節(jié)pH至中性。最后將產(chǎn)物置于45 ℃烘箱中干燥后粉碎封袋保存。

2.2 阿魏酸藜麥淀粉酯的制備

稱取8 g原藜麥淀粉于100 mL燒杯中，加入80 mL有機(jī)溶劑異辛烷，其中未加酶的反應(yīng)條件：精確稱取0.4 g阿魏酸加入到燒杯中，35 ℃水浴鍋中磁力攪拌9 h；豬胰脂肪酶的催化反應(yīng)條件：精確稱取0.4 g阿魏酸與0.16 g豬胰脂肪酶混合加入到燒杯中，35 ℃水浴鍋中磁力攪拌9 h；Novozym435脂肪酶的催化反應(yīng)條件：精確稱取0.4 g阿魏酸與0.16 gNovozym435脂肪酶混合加入到燒杯中，70 ℃水浴鍋中磁力攪拌5 h。反應(yīng)結(jié)束后用無水乙醇反復(fù)離心(5 000 r/min，10 min)清洗除去未反應(yīng)的阿魏酸，洗滌后將樣品置于50 ℃烘箱中烘干，研磨后備用。

2.3 取代度的測定

采用UV-1 200S型紫外可見分光光度計(jì)對產(chǎn)物取代度進(jìn)行測定，將產(chǎn)物的堿水解液用乙酸乙酯萃取后，測得水解后阿魏酸的吸光度值，經(jīng)回歸方程計(jì)算其含量，從而計(jì)算出取代度。

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取一定量的阿魏酸定容于一定體積的乙酸乙酯中后稀釋，配制得到質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5、6 μg/mL的阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，在320 nm處測定不同濃度溶液的吸光度值，以溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制得到阿魏酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2 取代度的計(jì)算

淀粉酯的水解：稱取0.1 g干燥后的產(chǎn)物，加入到50 mL帶塞三角瓶中，加入30 mL 1 mol/L的NaOH溶液，在50 ℃磁力攪拌下水解3 h，水解后用1 mol/L鹽酸滴定至pH 2左右，移取20 mL水解液于分液漏斗中，用100 mL乙酸乙酯萃取4次，備用。

利用UV紫外可見分光光度計(jì)，在320 nm下測定萃取液吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到阿魏酸含量，并按公式計(jì)算取代度：

式中：W為阿魏酸在阿魏酸淀粉酯中的質(zhì)量百分比/%；C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的阿魏酸濃度/g/L；V為萃取液體積/L；m0為產(chǎn)物質(zhì)量/g；M為阿魏酸相對分子質(zhì)量，194.19。

2.4 掃描電子顯微鏡

將一定量的淀粉充分分散于固定在載物臺(tái)上雙面導(dǎo)電膠上，用洗耳球吹去多余未粘附的樣品，在真空條件下進(jìn)行鍍金處理后觀察，加速電壓為15 kV，放大倍數(shù)分別為5 000倍和20 000倍。

2.5 傅里葉紅外光譜

稱取5 mg(干基)樣品與溴化鉀粉末混合均勻后研磨，采用壓片法制樣并放入紅外光譜分析儀進(jìn)行測試，掃描波長范圍為(500～4 000)cm-1。先在室溫下以空氣為背景波長掃描，后對樣品進(jìn)行掃描。

2.6 X-射線衍射

X-射線衍射分析參考楊慶余等[15]的方法略作調(diào)整：室溫下用D-max-2 500型X射線衍射儀測定，采用Cu-Kα靶，石墨單色器、40 kV和2 000 mA，掃描速度為2(°)/min，掃描范圍在3～40°。相對結(jié)晶度根據(jù)Miao等[16]進(jìn)行計(jì)算，X-射線衍射數(shù)據(jù)采用MDI Jade 6.0進(jìn)行擬合處理，對原始圖進(jìn)行平滑處理。相對結(jié)晶度采取公式計(jì)算：

式中：Ac和An分別代表結(jié)晶區(qū)域和無定型區(qū)域，Xc為結(jié)晶度。

2.7 熱特性分析

使用差示掃描量熱儀(DSC，TA，Q20)進(jìn)行測定，稱取3.0 mg(干基)淀粉樣品放于鋁制坩堝中，按質(zhì)量比1∶2比例加入蒸餾水，將坩堝用壓蓋密封平衡水分后進(jìn)行測定，以空坩堝作參比，掃描溫度范圍為20～140 ℃，掃描速度10 ℃/min。每個(gè)樣品適當(dāng)重復(fù)3次，取其平均值。

2.8 糊化特性分析

糊化特性的測定參考潘治利[17]的方法并加以改進(jìn)，采用快速黏度測定儀(RVA)分析淀粉的糊化特性。準(zhǔn)確稱取3.00 g淀粉樣品和25 mL蒸餾水于鋁盒內(nèi)，按12%的濕基校正。然后在RVA上按以下程序測試：初始攪拌速率960 r/min，10 s后，待形成均勻懸濁液，在50 ℃條件下恒溫1 min，再以12℃/min由50 ℃上升至95 ℃并恒溫3 min，之后以同樣的速率由95 ℃下降至50 ℃，并恒溫3 min，測試結(jié)束。樣品平行測3次，所有特征參數(shù)取3次數(shù)據(jù)平均值。

2.9 DPPH自由基清除力的測定

DPPH自由基清除力的測定參考王萍萍[18]的方法略作調(diào)整。

2.00×10-4mol/L DPPH溶液的配制：精確稱取0.007 8 g DPPH試劑于100 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容。

移取2 mL樣品溶液和2 mL DPPH無水乙醇溶液于10 mL試管中，混勻，避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測定其吸光度，原藜麥淀粉作空白，平行測定3次。

DPPH自由基清除率按公式計(jì)算：

式中：A0為原藜麥淀粉+DPPH的吸光度；AS為樣品淀粉+DPPH的吸光度。

2.10 數(shù)據(jù)分析

每次實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次平行，數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差分析采用Duncan’s方法，用Origin9.1軟件繪圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同條件制備的阿魏酸藜麥淀粉酯取代度的測定

3.1.1 阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用UV-1 200S型紫外可見分光光度計(jì)對不同質(zhì)量濃度的阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，得到的回歸方程為：y=0.100 4x-0.000 1，R2=0.999 5。

3.1.2 取代度測定結(jié)果

圖1是不同條件制備的阿魏酸藜麥淀粉酯取代度。由圖1可知，QSFA-1、QSFA-2和QSFA-3的取代度分別為0.16%、0.23%、0.39%。由此可見，原藜麥淀粉與阿魏酸用Novozym435脂肪酶催化制備的阿魏酸藜麥淀粉酯的取代度最高，而豬胰脂肪酶催化制備的阿魏酸藜麥淀粉酯取代度偏低，說明脂肪酶的種類對于阿魏酸淀粉酯的合成有很大關(guān)系。這可能是因?yàn)镹ovozym435脂肪酶更容易催化有機(jī)溶劑中的酯化反應(yīng)，酶的活性中心與阿魏酸更有效的結(jié)合從而使催化效率更高[19]。

注：QSFA-1、QSFA-2、QSFA-3分別為原藜麥淀粉+FA制得的阿魏酸藜麥淀粉酯、原藜麥淀粉+FA+豬胰脂肪酶制得的阿魏酸藜麥淀粉酯、原藜麥淀粉+FA+Novozym435制得的阿魏酸藜麥淀粉酯。圖1 不同條件制備的阿魏酸藜麥淀粉酯的取代度

3.2 不同條件制備的阿魏酸藜麥淀粉酯的電鏡分析

圖2為原藜麥淀粉和阿魏酸藜麥淀粉酯的掃描電鏡圖。從圖2中可以看出，原藜麥淀粉顆粒的形狀為多邊形，顆粒的形狀比較均勻，淀粉顆粒的表面比較平滑。而在阿魏酸藜麥淀粉酯的顆粒表面觀察到部分團(tuán)聚體，并且隨著阿魏酸取代度的升高，阿魏酸藜麥淀粉酯顆粒的表面變得更加粗糙，顆粒形貌的變化程度加劇。這可能是因?yàn)槿芙獾陌⑽核崤c淀粉顆粒通過氫鍵相互作用使淀粉顆粒表面失去原有的平順性[20]，或者淀粉顆粒在酯化過程中發(fā)生斷裂被羥基取代并且發(fā)生凝膠化，使淀粉顆粒的表面變得粗糙。

注：NQS為原藜麥淀粉a1、b1、c1、d1分別為：NQS、QSFA-1、QSFA-2、QSFA-3 (×5 000)；a2、b2、c2、d2分別為：NQS、QSFA-1、QSFA-2、QSFA-3 (×20 000)。圖2 原藜麥淀粉與不同條件制備的阿魏酸藜麥淀粉酯的電鏡圖

3.3 不同條件制備的阿魏酸藜麥淀粉酯的紅外光譜分析

圖3是原藜麥淀粉和阿魏酸藜麥淀粉酯的傅里葉紅外光譜圖。在原藜麥淀粉中，光譜的指紋區(qū)域由923～1 162 cm-1之間的三個(gè)特征峰組成，歸因于C—O鍵伸展，2 926 cm-1處的尖銳帶是與環(huán)次甲氧氫原子相關(guān)的C—H伸展，由于氫鍵合的羥基相關(guān)的復(fù)雜振動(dòng)伸展，在3 250～3 650 cm-1處有吸收峰。而在阿魏酸藜麥淀粉酯的圖譜中，1 650～1 700 cm-1之間新峰的出現(xiàn)與酯基的特征峰出峰的范圍相吻合，由此證明了酯鍵的生成。此外，在2 933 cm-1附近為苯環(huán)上O—CH3的不對稱伸縮振動(dòng)峰。由此說明，以異辛烷作為反應(yīng)介質(zhì)的有機(jī)溶劑體系，采用豬胰脂肪酶和Novozym435脂肪酶作為催化劑可以合成阿魏酸藜麥淀粉酯。

圖3 原藜麥淀粉與不同條件制備的阿魏酸藜麥淀粉酯的紅外光譜圖

3.4 不同條件制備的阿魏酸藜麥淀粉酯的X-射線衍射分析

由圖4可知，原藜麥淀粉和阿魏酸藜麥淀粉酯均在2θ為15°、17°和23°處有強(qiáng)吸收峰，說明原藜麥淀粉和阿魏酸藜麥淀粉酯都屬于A型結(jié)構(gòu)。原藜麥淀粉和阿魏酸藜麥淀粉酯的結(jié)晶度分別為24.65%、17.78%、17.10%、19.93%，阿魏酸藜麥淀粉酯的結(jié)晶度均低于原藜麥淀粉?？赡苁且?yàn)樵见湹矸叟c阿魏酸在非水相中發(fā)生反應(yīng)，淀粉顆粒的結(jié)晶區(qū)受到不同程度的破壞，淀粉顆粒失去了原有結(jié)晶結(jié)構(gòu)，排列規(guī)整的結(jié)晶單位數(shù)量減少[21]，無定型區(qū)域增加，原藜麥淀粉的分子結(jié)構(gòu)更加趨于無序化。

圖4 原藜麥淀粉與不同條件制備的阿魏酸藜麥淀粉酯的X-射線衍射圖

3.5 不同條件制備的阿魏酸藜麥淀粉酯的熱特性分析

表1為原藜麥淀粉和阿魏酸藜麥淀粉酯的DSC參數(shù)表。由表1可知，原藜麥淀粉的糊化起始溫度(T0)為54.77 ℃，峰值溫度(Tp)為62.76 ℃，終值溫度(Tc)為81.31 ℃，焓值為15.67 J/g。阿魏酸藜麥淀粉酯的凝膠焓值均低于原藜麥淀粉，凝膠焓值變化趨勢與結(jié)晶度結(jié)果相一致。凝膠焓值降低的原因可能是膨脹的淀粉顆粒中部分相鄰葡萄糖單元之間氫鍵發(fā)生斷裂[22]，淀粉分子間的雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生解旋，淀粉顆粒的部分結(jié)晶結(jié)構(gòu)被破壞，使分子結(jié)構(gòu)的無定化程度提高。因此，阿魏酸藜麥淀粉酯的焓值低于原藜麥淀粉。原藜麥淀粉僅有1個(gè)吸熱峰，而阿魏酸藜麥淀粉酯出現(xiàn)了2個(gè)吸熱峰，其中第一個(gè)為原藜麥淀粉的糊化吸熱峰，第二個(gè)即為阿魏酸藜麥淀粉酯的裂解峰，證明了阿魏酸藜麥淀粉酯的形成。

3.6 不同條件制備的阿魏酸藜麥淀粉酯的糊化特性分析

圖5為原藜麥淀粉和阿魏酸藜麥淀粉酯的黏度圖譜。由圖5可知，與原藜麥淀粉相比，阿魏酸藜麥淀粉酯的起始黏度、峰值黏度和終值黏度呈下降趨勢。這可能是由于多酚具有多元結(jié)構(gòu)，其羥基與支鏈淀粉的側(cè)鏈發(fā)生反應(yīng)，并且與淀粉顆粒的無定型區(qū)發(fā)生不同程度的結(jié)合，從而改變晶質(zhì)和無定型質(zhì)之間的偶合力，促使淀粉顆粒之間發(fā)生簡單水合，使糊化熱能減少[23]。其次，在酯化過程中，化學(xué)修飾導(dǎo)致部分或全部淀粉分子斷裂，從而削弱其膨脹能力。此外，在酯化反應(yīng)中發(fā)生一定程度的解聚反應(yīng)，這也可能導(dǎo)致黏度降低。以豬胰脂肪酶為催化劑制得的阿魏酸藜麥淀粉酯的黏度極低，可能的原因是反應(yīng)體系中淀粉分子上更多的糖苷鍵發(fā)生斷裂，或者劇烈的剪切作用使淀粉分子之間的作用減弱，相互纏繞的淀粉分子發(fā)生定向排列，聚集程度下降，從而導(dǎo)致黏度降低[24-25]。

表1 原藜麥淀粉與不同條件制備的阿魏酸藜麥淀粉酯的熱特性參數(shù)

圖5 原藜麥淀粉與不同條件制備的阿魏酸藜麥淀粉酯的黏度曲線

3.7 不同條件制備的阿魏酸藜麥淀粉酯DPPH自由基清除率結(jié)果分析

圖6為不同條件制備的阿魏酸藜麥淀粉酯的抗氧化結(jié)果。隨著阿魏酸藜麥淀粉酯的取代度增加，DPPH自由基的清除率也隨之增強(qiáng)，QSFA-1、QSFA-2和QSFA-3的DPPH自由基清除率分別為9.55%、17.05%和28.78%。高取代度的阿魏酸淀粉酯，其DPPH自由基的清除效果越好，證明阿魏酸在藜麥淀粉上接枝的量越多，阿魏酸淀粉酯的抗氧化能力越高，這與Yu等[14]報(bào)道的結(jié)果一致。因此，DS-FA0.39%中結(jié)合的阿魏酸有助于提高藜麥淀粉的抗氧化能力。

圖6 原藜麥淀粉與不同條件制備的阿魏酸藜麥淀粉酯的DPPH自由基清除率

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用非水相酶法制備阿魏酸藜麥淀粉酯，阿魏酸藜麥淀粉酯顆粒表面變粗糙，結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化。傅里葉紅外光譜圖證明了阿魏酸成功接到藜麥淀粉骨架上，阿魏酸藜麥淀粉酯的結(jié)晶度均比原藜麥淀粉的結(jié)晶度低，阿魏酸藜麥淀粉酯的無定型區(qū)增加。熱特性測定表明阿魏酸藜麥淀粉酯出現(xiàn)兩個(gè)吸熱峰，第二個(gè)吸收峰為阿魏酸藜麥淀粉酯復(fù)合物的吸收峰。Novozym435脂肪酶對于催化合成阿魏酸藜麥淀粉酯的效果優(yōu)于豬胰脂肪酶，其取代度為0.39%。阿魏酸藜麥淀粉酯具有較好的抗氧化特性，隨著取代度的升高，DPPH清除率升高，抗氧化能力增強(qiáng)。