吳秀萍 耿榮華 曲 芬*

念珠菌是住院患者中侵襲性真菌感染最主要的病原菌，為成年人重癥監(jiān)護(hù)室(intensive care unit，ICU)中血流感染和導(dǎo)管相關(guān)性尿路感染最常見的病原，并呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，在我國(guó)居血流感染病原菌的第四位，并呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)[1-2]。真菌的耐藥率及死亡率的逐漸增加，嚴(yán)重威脅患者的生命健康[3-4]。在抗真菌藥物的使用過程中，伏立康唑是目前臨床用于治療一線真菌感染的首選藥物，并取得良好的治療效果[5]。但由于其價(jià)格昂貴、不良反應(yīng)大等問題成為臨床上治療念珠菌感染棘手的問題[6]。大蒜素是從大蒜中提取的含硫有機(jī)化合物，其主要的有效成分為二烯丙基三硫化物，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明，其具有抗炎、抗菌及抗氧化等作用，且生物性能好、毒副作用小、已被廣泛應(yīng)用于臨床抗感染治療[7]。目前，為尋找更好的抗真菌療法，聯(lián)合應(yīng)用不同藥理作用機(jī)制的抗真菌藥物，減少其不良反應(yīng)及耐藥問題的研究正在展開。本研究旨在評(píng)價(jià)伏立康唑和大蒜素聯(lián)合抗念珠菌的體外活性，以期為臨床治療念珠菌感染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

收集于2016-2019年航空總醫(yī)院臨床微生物室送檢的79株念珠菌臨床標(biāo)本，包括白色念珠菌(Candida albicans)58株、光滑念珠菌(Candida glabratas)10株、熱帶念珠菌(Candida tropicalis)6株以及近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)5株。以白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC90029為質(zhì)量控制菌株。

1.2 抗菌藥物

大蒜素(Garlicin)，規(guī)格為20 mg，北京索萊寶科技有限公司；伏立康唑(voriconazole)，規(guī)格為1 g，北京索萊寶科技有限公司。

1.3 儀器與試劑

采用VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀(法國(guó)生物梅里埃公司)；酵母樣真菌鑒定卡、酵母樣真菌藥敏卡(微量稀釋法；法國(guó)生物梅里埃BioMerieux公司)；酶標(biāo)儀：Sunrise(瑞士Tecan公司)；沙保羅瓊脂培養(yǎng)粉(杭州濱和有限公司)；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾儀器有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌液配置

從-80 ℃冰箱取出待測(cè)菌，室溫下融化，接種于沙堡羅瓊脂培養(yǎng)基35 ℃下孵育24 h；取單一的菌落再轉(zhuǎn)接種于沙保羅瓊脂培養(yǎng)基35 ℃孵育24 h，以確保菌種的活力，挑菌落置于3 ml 0.85%的生理鹽水中，用牛鮑氏計(jì)數(shù)盤計(jì)真菌數(shù)量，再用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，終濃度約為2.0×103CFU/ml。

1.4.2 藥液配置

實(shí)驗(yàn)時(shí)用100%二甲基亞砜(DMSO)將伏立康唑溶解制成640 μg/ml，配制過程中應(yīng)劇烈振蕩，直至完全溶解為止，將無(wú)菌貯存液分裝至無(wú)菌的聚丙烯小管內(nèi)，存于-80 ℃冰箱，用時(shí)取出。用RPMI1640培養(yǎng)基倍比稀釋，初濃度為64 μg/ml，終濃度為0.06 μg/ml。用RPMI1640培養(yǎng)液將大蒜素配制成1024 μg/ml的原液，用RPMI1640培養(yǎng)液倍比稀釋使大蒜素終濃度為128 μg/ml。

1.4.3 單藥最低抑菌濃度測(cè)定

最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)的操作方法按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的微量稀釋法。伏立康唑：0.06～64 μg/ml；大蒜素：4～128 μg/ml，每孔加100 μl于96孔板中，再加入100 μl含菌培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照為100 μl含菌培養(yǎng)液培養(yǎng)和100 μl無(wú)藥培養(yǎng)液，陰性對(duì)照孔為不含菌不含藥的培養(yǎng)液。置于35 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。酶標(biāo)儀檢測(cè)96孔板吸光度值(OD值)，最低抑菌濃度(MIC50)為與陽(yáng)性對(duì)照相比吸光度值下降50%，最低抑菌濃度(MIC90)為與陽(yáng)性對(duì)照相比吸光度值下降90%。

1.4.4 棋盤法聯(lián)合藥物體外抗真菌作用

采用棋盤微量稀釋法實(shí)驗(yàn)，用倍比稀釋的伏立康唑50 μl加入96孔板的A～H行中，用倍比稀釋的大蒜素50 μl加入96孔板的1～8列中。藥物的濃度：大蒜素為4～128 μg/ml，伏立康唑?yàn)?.06～64 μg/ml。于每孔中加入100 μl菌液，陽(yáng)性對(duì)照為100 μl含菌培養(yǎng)液和100 μl無(wú)藥培養(yǎng)液，陰性對(duì)照孔為不含菌不含藥的培養(yǎng)液。置于35 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.5 抗菌后效應(yīng)

實(shí)驗(yàn)設(shè)檢測(cè)管T管和對(duì)照管C管，T管用大蒜素加伏立康唑原液作用念珠菌2 h(菌液終濃度為1×106CFU/ml，藥液濃度為10倍于MIC的濃度)，C管無(wú)藥液的對(duì)照，同步35 ℃培養(yǎng)2 h。T管、C管離心除去藥物后，加入RPMI1640培養(yǎng)液，恢復(fù)至初始體積，此時(shí)記為觀察的零點(diǎn)。T管和C管同步置于35 ℃培養(yǎng)8 h。

1.5 判斷標(biāo)準(zhǔn)

采用分級(jí)抑菌濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI)法判定藥物聯(lián)合作用效果，其FICI法計(jì)算為公式1：

FICI≤0.5協(xié)同作用，0.5～1相加作用，1～2無(wú)關(guān)作用，＞2拮抗作用[8]。

2 結(jié)果

在79株念珠菌中，包括伏立康唑敏感的69株和耐藥的10株，耐藥菌株包括7株光滑假絲酵母、3株熱帶假絲酵母。對(duì)伏立康唑敏感的69株念珠菌對(duì)5-氟胞嘧啶、伊曲康唑、兩性霉素B和氟康唑均敏感，對(duì)伏立康唑耐藥的10株念珠菌對(duì)真菌藥敏試劑盒的其他4種藥物均耐藥。

2.1 單藥聯(lián)合用藥MIC變化

聯(lián)合用藥較單一用藥的MIC50和MIC90均有明顯降低。聯(lián)合用藥對(duì)伏立康唑敏感的念珠菌MIC50伏立康唑降低2倍、大蒜素降低8倍(分別為由0.06 μg/ml降至0.03 μg/ml、16μg/ml降至2 μg/ml)，對(duì)伏立康唑耐藥的念珠菌MIC50伏立康唑降低2倍、大蒜素降低8倍(分別為由32 μg/ml降至4 μg/ml、4 μg/ml降至0.5 μg/ml)，大蒜素與伏立康唑單用和聯(lián)合應(yīng)用對(duì)敏感和耐藥的念珠菌的MIC比較見表1。

2.2 FICI值

在79株菌株中，F(xiàn)ICI≤0.5為100%，表現(xiàn)為協(xié)同作用。

表1 大蒜素與伏立康唑聯(lián)用對(duì)敏感和耐藥念珠菌MIC的比較(μg/ml)

2.3 抗菌后效應(yīng)

大蒜素與伏立康唑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)敏感念珠菌的抗菌后效應(yīng)(post antibiotic effect，PAE)為1.31 h；大蒜素與伏立康唑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)耐藥念珠菌的PAE為1.7 h，見圖1。

圖1 大蒜素與伏立康唑聯(lián)用對(duì)敏感和耐藥菌株P(guān)AE的比較

3 討論

念珠菌的種類很多，常見的有白色念珠菌、光滑念珠菌，熱帶念珠菌等，在侵襲性真菌感染中，白色念珠菌感染占首位，其次是光滑、近平滑念珠菌[9]。中藥作為祖國(guó)傳統(tǒng)用藥有著悠久的歷史，在治療疾病方面具有天然的優(yōu)勢(shì)，其取材方便和不良反應(yīng)小。大蒜素對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、寄生蟲和病毒均有良好的抑制作用[10]。大蒜素在臨床抗感染治療中取得較好的效果，而聯(lián)合用藥能顯著提高單藥的抗菌作用，大蒜素聯(lián)合制霉菌素治療鵝口瘡能顯著提高有效率，降低復(fù)發(fā)率[11]；聯(lián)合抗菌藥物治療細(xì)菌感染呼吸機(jī)有關(guān)的肺炎時(shí)能顯著降低抗生素使用時(shí)間及ICU的住院時(shí)間，從而降低不良反應(yīng)的產(chǎn)生[12]。Khodavandi等[13]報(bào)道，大蒜素與唑類藥物聯(lián)用有協(xié)同作用。

本實(shí)驗(yàn)研究選取了臨床標(biāo)本分離的白色念珠菌、光滑念珠菌等常見的念珠菌，以棋盤式微量稀釋法初步確定了大蒜素抗念珠菌和大蒜素與伏立康唑聯(lián)合應(yīng)用的抗念珠菌的作用效果，結(jié)果顯示大蒜素與伏立康唑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，MIC50及MIC90均降低，尤其是對(duì)耐伏立康唑的菌株，可以極大減少伏立康唑的用量，從而確定大蒜素可增強(qiáng)伏立康唑的抗菌活性，且具有協(xié)同作用。

4 結(jié)論

聯(lián)合應(yīng)用大蒜素和伏立康唑后對(duì)敏感菌株的PAE為1.3 h，對(duì)耐藥菌株的PAE為1.7 h，為大蒜素與伏立康唑的聯(lián)合應(yīng)用提供藥理學(xué)參數(shù)，可以根據(jù)藥理學(xué)參數(shù)適當(dāng)延長(zhǎng)給藥時(shí)間，減少用藥的總量。