楊秀成 于瓊 鞏林強(qiáng) 楊艷★

結(jié)腸癌是消化道常見(jiàn)惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于肺癌和乳腺癌，其發(fā)生原因與飲食、環(huán)境、種族、遺傳等多種因素有關(guān)[1]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）是VEGF家族中的成員之一，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3（vascular endothelial growth factor receptor3，VEGFR-3）是酪氨酸激酶家族成員之一，胚胎發(fā)育早期在心血管系統(tǒng)中表達(dá)，成年之后，僅在淋巴內(nèi)皮上表達(dá)[2]，而在結(jié)直腸正常組織中檢測(cè)不到表達(dá)[3]。胰島素生長(zhǎng)因子1（Insulin-like growth factor 1，IGF-1）是一種具有細(xì)胞增殖調(diào)控作用的低分子多肽，在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，并參與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移過(guò)程[4]。本研究通過(guò)檢測(cè)結(jié)腸癌患者血清IGF-1水平及腫瘤組織中VEGF-C、VEGFR-3表達(dá)情況，分析三者間關(guān)系，以期為結(jié)腸癌患者預(yù)后提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

血清樣本和組織標(biāo)本均來(lái)自于2016年5月至2017年7月本院接受手術(shù)治療的60例結(jié)腸癌患者和60例結(jié)腸腺瘤患者，分別作為結(jié)腸癌組和結(jié)腸腺瘤組，同一結(jié)腸癌組織標(biāo)本癌旁正常組織作為癌旁正常組。結(jié)腸癌和癌旁正常組中，男36例，女24例，年齡46～77歲，平均（61.22±7.68）歲；結(jié)腸腺瘤組中，男33例，女27例，年齡45～75歲，平均（62.18±6.25）歲。另選取60例體檢健康者作為健康組，其中男性35例，女性25例，年齡44～78歲，平均（61.82±7.36）歲，3組性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。健康組收集血清作為對(duì)照，血清樣本貯存于-80°冰箱備用。結(jié)腸癌組、結(jié)腸腺瘤組、癌旁正常組的組織標(biāo)本采用福爾馬林固定，石蠟包埋后備用。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

結(jié)腸癌組納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)腸鏡活檢或手術(shù)檢查確診；②符合《常見(jiàn)消化系腫瘤診治學(xué)》[5]中結(jié)腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前接受相關(guān)治療；②肛管癌、結(jié)直腸多發(fā)性息肉者；③有手術(shù)禁忌證者；④處于妊娠期或哺乳期者。

結(jié)腸腺瘤組納入標(biāo)準(zhǔn)：①均采用手術(shù)切除治療；②符合《常見(jiàn)消化系腫瘤診治學(xué)》[5]中結(jié)腸腺瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)；①合并腎功能障礙、陳舊性心肌梗死、冠心病者；②嚴(yán)重潰瘍性結(jié)腸炎者；③伴有腸內(nèi)容物潴留者；④處于妊娠期或哺乳期者。

1.2 主要試劑

兔抗人VEGF-C多克隆抗體（E-AB-33567）購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；兔抗人VEGFR-3多克隆抗體（bs-1083R-1）購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司；鼠抗人D2-40 單克隆抗體（ZM-0465）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；即用型快捷免疫組化MaxVision TM 試劑盒（KIT-5002）購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；二氨基聯(lián)苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒（ZLI-9019-10ML）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；IGF-1 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（XNDW36）購(gòu)自上海旭年生物科技有限公司。

1.3 IGF-1 檢測(cè)方法

采集受試者清晨空腹靜脈血5 mL，獲取血清，根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)血清IGF-1水平。

1.4 免疫組化方法

石蠟連續(xù)切片，厚度控制在4～5 μm 作用，采用3%過(guò)氧化氫處理10 min 左右，將內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗干凈后，熱修復(fù)15 min。PBS 沖洗3次，一抗4℃封閉過(guò)夜，PBS 沖洗干凈后，二抗常溫下孵育20 min。然后PBS 充分沖洗，二氨基聯(lián)苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）顯色后采用蘇木素復(fù)染。最后脫水、透明、封片，進(jìn)行鏡檢。

結(jié)果判定[6]：在腫瘤區(qū)選取5個(gè)視野，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分，低于5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%之間為2分，51%～75%為3分，75%以上為4 分；根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分，不著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3 分。通過(guò)兩者乘積判斷結(jié)果，即0～4 分為陰性，5 分以上為陽(yáng)性。

1.5 微淋巴管密度（micro-lymphatic vessel density，LMVD）的判定

D2-40 陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿及細(xì)胞膜，按照Weidner 法計(jì)算LMVD，先于低倍鏡下選取熱點(diǎn)，然后調(diào)整至200倍鏡，選取4個(gè)視野計(jì)算微淋巴管總數(shù)，LMVD值取其均值[7]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析計(jì)數(shù)資料用%表示，行χ2檢驗(yàn)，多組之間兩兩比較采用卡方分割比較。相關(guān)性分析采用Spearman 等級(jí)相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清IGF-1水平比較

3組間血清IGF-1水平比較，結(jié)腸癌組血清IGF-1水平顯著高于結(jié)腸腺瘤組和健康組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組血清IGF-1水平比較[（±s）]Table1 Comparison of serum IGF-1 level in each group[（±s）]

表1 各組血清IGF-1水平比較[（±s）]Table1 Comparison of serum IGF-1 level in each group[（±s）]

注：結(jié)腸癌組與健康組比較，q=24.829，aP=0.000，結(jié)腸癌組與結(jié)腸腺瘤組比較，q=7.919，bP=0.000。

組別結(jié)腸癌組結(jié)腸腺瘤組健康組F 值P 值n 60 60 60 IGF-1（ng/mL）145.83±18.32ab 123.27±12.30 82.52±7.38 49.538 0.000

2.2 各組VEGF-C和VEGFR-3表達(dá)情況比較

結(jié)腸癌組的細(xì)胞胞質(zhì)中可見(jiàn)棕黃色染色顆粒，VEGF-C和VEGFR-3表達(dá)呈陽(yáng)性，見(jiàn)圖1A，圖1B。3組間VEGF-C和VEGFR-3 陽(yáng)性表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)腸癌組VEGF-C和VEGFR-3 陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于結(jié)腸腺瘤組和癌旁組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

圖1 結(jié)腸癌腫瘤組織中VEGF-C和VEGFR-3 呈陽(yáng)性表達(dá)（SP 法，200×）Figure1 Positive expressions of VEGF-C and VEGFR-3 in colon cancer tumor tissues（SP 法，200×）

表2 各組VEGF-C和VEGFR-3表達(dá)情況比較[n（%）]Table2 Comparison of expressions of VEGF-C and VEGFR-3 in each group[n（%）]

2.3 結(jié)腸癌組血清IGF-1水平、組織VEGF-C和VEGFR-3表達(dá)與病理特征關(guān)系

結(jié)腸癌患者血清IGF-1水平與腫瘤直徑、分化程度、浸潤(rùn)程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，結(jié)腸癌腫瘤組織VEGF-C 陽(yáng)性表達(dá)與分化程度、浸潤(rùn)程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，結(jié)腸癌腫瘤組織VEGFR-3 陽(yáng)性表達(dá)與浸潤(rùn)程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

2.4 LMVD值與結(jié)腸癌病理特征關(guān)系

淋巴管在腫瘤組織中分布不均，腫瘤邊緣區(qū)域的LMVD 明顯高于腫瘤內(nèi)部區(qū)域，且邊緣區(qū)域淋巴管形態(tài)不一，多呈擴(kuò)張狀態(tài)，而內(nèi)部區(qū)域淋巴管多表現(xiàn)為無(wú)腔、條索狀，為無(wú)功能型。結(jié)腸癌組LMVD值為（3.86±1.14），結(jié)腸腺瘤組LMVD值為（1.45±0.41），癌旁組LMVD值為（0.76±0.16），結(jié)腸癌組LMVD值明顯高于結(jié)腸腺瘤組和癌旁組（q1=15.409，q2=20.859，P＜0.05）。LMVD值與結(jié)腸癌浸潤(rùn)程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表3 結(jié)腸癌組血清IGF-1水平、組織VEGF-C和VEGFR-3表達(dá)與病理特征關(guān)系[（n（%），（±s）]Table3 Relationship between serum IGF-1 level，expressions of VEGF-C and VEGFR-3 in tissues and pathological features in colon cancer group[（n（%），（±s）]

表3 結(jié)腸癌組血清IGF-1水平、組織VEGF-C和VEGFR-3表達(dá)與病理特征關(guān)系[（n（%），（±s）]Table3 Relationship between serum IGF-1 level，expressions of VEGF-C and VEGFR-3 in tissues and pathological features in colon cancer group[（n（%），（±s）]

病理特征性別年齡（歲）腫瘤直徑（cm）分化程度浸潤(rùn)程度淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移男女＜60≥60＜5≥5高、中分化低分化T1-T2 T3-T4有無(wú)n 36 24 15 45 23 37 49 11 41 19 37 23 IGF-1（ng/mL）147.28±15.84 143.93±14.05 144.28±13.04 146.63±16.22 139.54±14.89 156.32±16.21 136.93±17.66 155.52±13.47 132.05±17.34 156.20±13.94 158.73±15.96 133.29±14.31 P 值0.405 0.508 0.000 0.002 0.000 0.000 VEGF-C 陽(yáng)性23（63.89）14（58.33）9（60.00）28（62.22）13（56.52）24（64.86）27（55.10）10（90.01）21（51.22）16（84.21）28（75.68）9（39.13）P 值0.665 0.878 0.518 0.027 0.014 0.005 VEGFR-3 陽(yáng)性22（61.11）13（54.17）9（60.00）26（57.78）11（47.83）24（64.86）27（55.10）8（72.72）20（48.78）15（78.95）26（70.27）9（39.13）P 值0.593 0.880 0.193 0.284 0.027 0.017

表4 LMVD值與結(jié)腸癌病理特征關(guān)系Table4 Relationship between LMVD value and pathological features of colon cancer

2.5 血清IGF-1與組織VEGF-C、VEGFR-3 及LMVD 的相關(guān)性分析

IGF-1與VEGF-C、VEGFR-3 及LMVD 均呈正相關(guān)（r=0.68，r=0.66，r=0.55，P＜0.05），VEGF-C和VEGFR-3與LMVD 均呈正相關(guān)（r=0.60，r=0.62，P＜0.05）。

3 討論

隨著飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣的改變，結(jié)腸癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，我國(guó)新發(fā)病例約為1.3萬(wàn)[8]。手術(shù)治療是結(jié)腸癌的主要治療方法，并輔以免疫、化療、中藥等綜合治療方案。治療后1～3年內(nèi)，許多患者會(huì)出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，而腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[9]。許多研究證實(shí)微血管的形成可促進(jìn)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移[10]，但關(guān)于微淋巴管形成對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響尚需進(jìn)一步探究。

IGF-1 是主要由肝臟合成的具有細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控作用的多肽類生長(zhǎng)因子，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，IGF-1 基因缺失的結(jié)直腸癌小鼠與對(duì)照組小鼠相比，腫瘤生長(zhǎng)緩慢，發(fā)病率明顯降低，說(shuō)明IGF-1 在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中起到促進(jìn)作用[11]。本研究結(jié)果顯示與田曉慧等人[12]研究結(jié)果一致。分析原因可能是IGF-1 通過(guò)與其受體結(jié)合激活酪氨酸酶活性，啟動(dòng)PI3K/AKT和MAPK 信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖分化，抑制癌細(xì)胞凋亡[13]。本研究進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，腫瘤直徑≥5 cm、低分化、浸潤(rùn)程度深、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的血清IGF-1水平明顯較高，說(shuō)明較高血清水平的IGF-1 可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

在淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移研究中，VEGF-C和VEGFR-3為熱門(mén)研究因子。本研究發(fā)現(xiàn)VEGFC和VEGFR-3 在結(jié)腸癌腫瘤組織中均表達(dá)上調(diào)，且浸潤(rùn)程度較深和伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者VEGF-C和VEGFR-3 陽(yáng)性率均明顯高于浸潤(rùn)程度淺、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，提示VEGF-C和VEGFR-3可促進(jìn)結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程，與在食管癌[14]、胃癌[15]等研究中結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組LMVD值明顯高于結(jié)腸腺癌組，且浸潤(rùn)程度深、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中LMVD值較浸潤(rùn)程度淺和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中LMVD值較高，提示LMVD值與結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因?yàn)槟[瘤邊緣區(qū)域淋巴管管壁基底膜不連續(xù)，腫瘤細(xì)胞易進(jìn)入新生淋巴管，有利于腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[16]。張澤進(jìn)等人[17]相關(guān)研究顯示，結(jié)腸癌組織VEGFR-C、VEGFR-3與LMVD呈正相關(guān)，本研究與上述研究結(jié)果一致。IGF-1與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，但是否與LMVD 及VEGF-C和VEGFR-3表達(dá)存在一定聯(lián)系，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，IGF-1與VEGF-C、VEGFR-3 及LMVD 均呈正相關(guān)，推測(cè)可能與IGF-1通過(guò)與其受體結(jié)合激活PI3-K 信號(hào)通路，誘導(dǎo)VEGF-C 表達(dá)上調(diào)有關(guān)，而VEGF-C 作為淋巴生成的關(guān)鍵因素，可激活VEGFR-3 以及后續(xù)一系列信號(hào)傳導(dǎo)通路，促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮增殖，在腫瘤邊緣區(qū)域形成新生微淋巴管，提高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率[18-19]。

綜上所述，結(jié)腸癌血清IGF-1水平以及組織中VEGF-C和VEGFR-3表達(dá)均明顯升高，高血清水平的IGF-1和VEGF-C和VEGFR-3 的陽(yáng)性表達(dá)與結(jié)腸癌淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，所以結(jié)腸癌血清IGF-1水平的檢測(cè)可在術(shù)前一定程度評(píng)估結(jié)腸癌惡化程度，且血清學(xué)檢測(cè)操作簡(jiǎn)單方便，可能可作為預(yù)測(cè)腫瘤發(fā)生發(fā)展的新的生物標(biāo)志物。另外IGF-1、VEGF-C和VEGFR-3 互呈正相關(guān)，共同促進(jìn)微淋巴管形成，阻斷IGF-1水平的升高可能成為減少VEGF-C和VEGFR-3表達(dá)，抑制結(jié)腸癌發(fā)展的新途徑。