田紅靜, 劉 通, 游 松, 張 峰*

(1. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院, 遼寧 沈陽(yáng) 110016; 2. 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所, 北京 100176)

環(huán)丙沙星(ciprofloxacin, CIP), 1-環(huán)丙基-6-氟-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-1,4-二氫喹啉-3-甲酸,屬于第三代喹諾酮類抗生素,具有抗菌譜廣、殺菌效果好、價(jià)格低廉、簡(jiǎn)單易得的優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物和人類的多種感染性疾病的治療[1]。然而,畜牧業(yè)中的不合理濫用及誤用,會(huì)導(dǎo)致一些動(dòng)物源性產(chǎn)品中存在痕量的環(huán)丙沙星殘留。長(zhǎng)期食用含有環(huán)丙沙星殘留的食品,可能會(huì)造成人體內(nèi)菌群失衡,耐藥菌株產(chǎn)生或人體中樞神經(jīng)損傷[2],甚至有“三致”風(fēng)險(xiǎn)[3],造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。針對(duì)這種情況,我國(guó)及一些其他國(guó)家和組織紛紛將環(huán)丙沙星列入限制使用的獸藥名單,并規(guī)定了最大殘留限量(MRL)[4]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告[5]中規(guī)定動(dòng)物源性食品中環(huán)丙沙星和恩諾沙星(ENR)合計(jì)的MRL為100 μg/kg,這與歐盟(EU)的相關(guān)規(guī)定[6]是一致的?？紤]到環(huán)丙沙星殘留的毒副作用,建立一種測(cè)定食品中痕量環(huán)丙沙星殘留的靈敏快速且廉價(jià)的分析方法至關(guān)重要。

目前已有的食品中喹諾酮類抗生素的檢測(cè)方法包括微生物檢測(cè)法[7]、分光光度法[8]、免疫分析法[9]、高效液相色譜法[10]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11]等。然而,由于食品基質(zhì)復(fù)雜以及環(huán)丙沙星殘留量較低,通常需要進(jìn)行繁瑣的樣品前處理。液液萃取(LLE)[12]、固相萃取(SPE)[13,14]、QuEChERS[15]、基質(zhì)固相分散萃取[16]是目前應(yīng)用較多的前處理方法,但難以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的特異性凈化富集,而且操作比較復(fù)雜繁瑣,因此,開(kāi)發(fā)易操作、高選擇性提取痕量環(huán)丙沙星的新方法十分必要。

分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers, MIPs)作為一種“人工抗體”,可為模板分子及其結(jié)構(gòu)類似物提供特定的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)和形狀,實(shí)現(xiàn)在復(fù)雜樣本基質(zhì)中目標(biāo)分子的特異性提取及富集[17]。MIPs作為固相萃取填料已被應(yīng)用到食品中抗生素殘留的檢測(cè)[18]。Wang等[19]合成了諾氟沙星分子印跡聚合物,并將其作為固相萃取填料與高效液相色譜聯(lián)用,檢測(cè)牛奶中的環(huán)丙沙星殘留,其吸附能力強(qiáng)(≥4 520 ng),檢測(cè)回收率高(≥96% ),檢出限(LOD)低(10 μg/L)。文獻(xiàn)[20]合成了一種蒙脫石磁性分子印跡聚合物(MMMIPs),并將其作為固相萃取材料提取牛奶中4種氟喹諾酮類抗生素,LODs介于12.9和18.8 μg/L 之間。然而,當(dāng)采用本體聚合方法制備得到MIPs并作為SPE填料,通常需要經(jīng)過(guò)稱重、裝填、離心等步驟,操作繁瑣,耗時(shí)較長(zhǎng)。為實(shí)現(xiàn)較快速檢測(cè),采用表面聚合方法,將分子印跡聚合物合成在固相載體上,可作為一種簡(jiǎn)化的前處理材料,實(shí)現(xiàn)復(fù)雜食品樣品中目標(biāo)物的快速檢測(cè)。Yang等[21]在攪拌棒表面涂布雙模板分子印跡聚合物,建立了可以同時(shí)檢測(cè)肉中9種喹諾酮類抗生素的攪拌吸附萃取(SBSE)方法,LODs為0.1～0.3 ng/g。Mirzajani等[22]在不銹鋼絲上制備了CIP分子印跡聚合物涂層并作為固相微萃取纖維,結(jié)合HPLC-UV檢測(cè)技術(shù)可實(shí)現(xiàn)血清、血漿和片劑制劑樣品中CIP的選擇性檢測(cè)。除攪拌棒和不銹鋼絲外,醋酸纖維素[23]、尼龍[24]和聚偏氟乙烯膜(PVDF)[25,26]等多孔膜材料也可以作為分子印跡材料的載體。將MIP合成在多孔膜表面,形成分子印跡膜(MIMs),并將其作為樣品前處理材料,可以從復(fù)雜樣品基質(zhì)中選擇性分離和提取目標(biāo)化合物,具有化學(xué)穩(wěn)定性好、耐受有機(jī)溶劑和成本低的優(yōu)點(diǎn)。但目前尚未有MIP修飾多孔膜選擇性分離提取食品樣品中環(huán)丙沙星的研究報(bào)道。

本研究使用分子印跡膜萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(MIME-HPLC-MS/MS)測(cè)定牛奶中痕量環(huán)丙沙星殘留。通過(guò)我們前期研究發(fā)現(xiàn),MIM存在較嚴(yán)重的模板泄露問(wèn)題,故使用結(jié)構(gòu)與環(huán)丙沙星非常相似的恩諾沙星(結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1)作為偽模板,實(shí)現(xiàn)環(huán)丙沙星的選擇性吸附,可以有效避免模板泄漏問(wèn)題。并考察了MIM的吸附容量,優(yōu)化了MIM的提取條件,建立了一種可以快速檢測(cè)牛奶中痕量環(huán)丙沙星的新方法。

圖 1 (a)恩諾沙星和(b)環(huán)丙沙星的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structures of the compounds (a) enrofloxacin (ENR) and (b) ciprofloxacin (CIP)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與樣品

Spark Holland SYMBIOSISTMPICO在線固相萃取-液相色譜(SPE-LC)儀,配有低壓四元泵、自動(dòng)脫氣裝置、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱(荷蘭Spark Holland公司); AB SCIEX Qtrap 6500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(含電噴霧離子源,美國(guó)愛(ài)博才思公司);高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)貝克曼公司);超純水系統(tǒng)(18.2 MΩ·cm,美國(guó)默克密理博公司)。

恩諾沙星、環(huán)丙沙星、頭孢羥氨芐(CFR)、磺胺嘧啶(SDZ)、阿奇霉素(AZI)、氧氟沙星(OFL)(純度>99% ,德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司); PVDF疏水膜(0.45 μm, Φ 13 mm,美國(guó)默克密理博公司);甲基丙烯酸(MAA)和乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)(美國(guó)Sigma-Aldrich公司);偶氮二異丁腈(AIBN,日本TCI公司);甲酸、乙酸(LC-MS級(jí),美國(guó)Fisher Scientific公司);甲醇、乙腈、乙醇、乙酸(HPLC級(jí),德國(guó)CNW Technologies公司);丙酮(HPLC級(jí),美國(guó)J. T. Baker公司)。

1.2 色譜-質(zhì)譜檢測(cè)條件

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱:Agilent ZORBAX SB-Aq(150 mm×4.6 mm, 3.5 μm,美國(guó)安捷倫科技公司);進(jìn)樣量3 μL;柱溫30 ℃;流速0.5 μL/min;流動(dòng)相A: 0.2%甲酸水;流動(dòng)相B: 0.1%甲酸乙腈;梯度洗脫條件為0～1.5 min, 90%A; 1.5～2 min內(nèi),A相降為50% ; 2～6.5 min內(nèi),A相繼續(xù)下降到20% ;之后到7 min, A相升到90% ;最后保持1 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

掃描方式:ESI+;檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);電噴霧電壓(IS): 5 500 V;霧化氣壓力(GS1): 379.2 kPa(55 psi);輔助氣壓力(GS2): 344.7 kPa (50 psi);氣簾氣壓力(CUR): 137.9 kPa (20 psi);離子源溫度(TEM): 550 ℃;駐留時(shí)間(DT): 100 ms。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表 1 CIP和ENR的MRM參數(shù)Table 1 MRM parameters for CIP and ENR

* Quantitative ion. CE: collision energy; DP: declustering potential.

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈配制成0.1 g/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,之后準(zhǔn)確稱取適量環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用乙腈稀釋成10 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)中間液;準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)中間液,用初始流動(dòng)相稀釋成0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 μg/L 系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 MIM與NIM的制備

參考文獻(xiàn)[26]報(bào)道的分子印跡膜制備方法,稍微加以改進(jìn),制備過(guò)程包括PVDF膜的活化以及分子印跡聚合物吸附PVDF膜兩個(gè)過(guò)程。

1.4.1 PVDF膜的活化

對(duì)PVDF膜進(jìn)行活化是為了去除膜上存在的殘留物,活化膜表面的親水物質(zhì)。首先將PVDF膜浸入純水10 min,再浸入乙腈10 min,之后浸入含有0.15 mol/L AIBN的乙腈溶液中20 min,取出后晾干。活化好的膜應(yīng)迅速放入分子印跡預(yù)聚液中。

1.4.2 MIM與非分子印跡膜(NIM)的合成

稱取1 mmol的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品于棕色試劑瓶中,隨后量取6 mmol的MAA功能單體,然后加入15 mL的氯仿-甲醇(5∶1, v/v)混合液,渦旋使之充分混勻,密封,室溫預(yù)聚合1 h。完成之后量取30 mmol的EGDMA交聯(lián)劑和2 mmol的AIBN引發(fā)劑加入到預(yù)聚液中,充分混勻后,加入上述活化好的PVDF膜,超聲除氧10 min,密封,室溫吸附2 h。反應(yīng)結(jié)束后將膜分裝在玻璃瓶中,氮?dú)獗Ｗo(hù)下恒溫65 ℃聚合24 h。隨后用甲醇-乙酸(9∶1, v/v)混合液做洗脫液,反復(fù)洗脫洗去膜上結(jié)合的模板分子,至平臺(tái)期后用純水洗滌膜表面至中性,然后用乙腈洗滌并干燥,保存于干燥器備用。

NIM的制備過(guò)程與MIM的制備過(guò)程除不加偽模板分子恩諾沙星外,步驟一致。

1.5 MIM吸附試驗(yàn)

1.5.1 吸附容量考察

取一張MIM和NIM分別放入到2 mL不同質(zhì)量濃度(10、50、100、200、300、500 μg/L)的環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液中,室溫振搖吸附20 min。吸附完成后,取吸附后的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)HPLC-MS/MS檢測(cè)。通過(guò)公式(1)計(jì)算平衡吸附容量[26]。

Qe=(C0-Ce)×V/A

(1)

其中Qe(ng/cm2)代表平衡吸附容量;C0(μg/L)代表溶液中待測(cè)物的初始濃度;Ce(μg/L)代表溶液中吸附待測(cè)物后的濃度;V(mL)代表溶液體積;A(cm2)代表MIM或NIM的面積。

為驗(yàn)證MIM的特異性,選擇氧氟沙星、頭孢羥氨芐、磺胺嘧啶、阿奇霉素作為環(huán)丙沙星的競(jìng)爭(zhēng)物,每種抗生素的質(zhì)量濃度均為200 μg/L,于2 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液中各加一張MIM和NIM,室溫振搖吸附20 min,將吸附后的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC-MS/MS檢測(cè)。通過(guò)公式(1)計(jì)算平衡吸附容量,比較MIM和NIM對(duì)各吸附物的吸附量;通過(guò)公式(2)計(jì)算分配系數(shù)Kd,評(píng)價(jià)MIM和NIM兩種吸附劑對(duì)不同抗生素的吸附效率;通過(guò)公式(3)計(jì)算選擇因子(k),評(píng)價(jià)MIM對(duì)不同抗生素的吸附能力差別;通過(guò)公式(4)計(jì)算相對(duì)選擇因子k′,用以顯示MIM和NIM對(duì)同一抗生素的吸附差別[27]。

Kd=(C0-Ce)×V/(Ce×A)=Qe/Ce

(2)

(3)

(4)

1.6 樣品的簡(jiǎn)單前處理及萃取

取市售牛奶5 g,加入10 mL乙腈混合,隨后加入2 g氯化鈉,渦旋振蕩5 min,在4 ℃下以8 000 r/min 離心10 min,取上清液,作為供試溶液。

取上述50 μL供試溶液滴加在一張MIM上,靜置20 min,然后,用200 μL去離子水清洗膜表面,去除非特異性吸附干擾物,最后用1 mL甲醇-冰乙酸(9∶1, v/v)超聲洗脫,重復(fù)3次,收集洗脫液并用N2吹干,1 mL初始流動(dòng)相復(fù)溶,過(guò)0. 22 μm微孔濾膜后待HPLC-MS/MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 MIM的傅里葉紅外光譜表征

對(duì)空白PVDF膜、MIM和NIM進(jìn)行傅里葉紅外光譜(FT-IR)測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)圖2。NIM和MIM的FT-IR譜圖中均存在 1 733 (1 719) cm-1附近的羰基(-C=O)伸縮振動(dòng)峰和 2 982(2 981) cm-1處羧基的伸縮振動(dòng)峰。一般來(lái)說(shuō),1 733 cm-1處的紅外吸收為-C=O的振動(dòng)吸收峰。然而,在MIM的FT-IR譜圖中,這個(gè)波段被紅移到了 1 719 cm-1,這是由于MIM中存在的模板分子恩諾沙星使得功能單體MAA中的-C=O與恩諾沙星中的質(zhì)子給體C-H或O-H形成氫鍵,導(dǎo)致MAA中的-C=O減弱,吸收峰紅移。并且,空白PVDF的FT-IR譜圖在 1 719(1 733) cm-1和 2 981(2 982) cm-1上未見(jiàn)明顯吸收,說(shuō)明有分子印跡層交聯(lián)在MIM和NIM膜表面。此外,在MIM上存在的 1 636 cm-1處4-吡啶酮的羰基伸縮振動(dòng)峰,進(jìn)一步證實(shí)了在MIM膜表面成功交聯(lián)上恩諾沙星分子印跡層。

圖 2 (a)空白PVDF膜、(b)MIM和(c)NIM的紅外光譜圖Fig. 2 FT-IR images of (a) blank polyvinylidene fluoride(PVDF) membrane, (b) molecularly imprinted membrane (MIM) and (c) non-molecularly imprinted membrane (NIM)

圖 3 MIM和NIM對(duì)不同初始濃度的環(huán)丙沙星的平衡吸附容量Fig. 3 Equilibrium adsorption capacity of MIM and NIM for ciprofloxacin under different concentrations

2.2 MIM吸附試驗(yàn)

2.2.1 吸附容量考察結(jié)果

MIM和NIM吸附不同濃度的環(huán)丙沙星的靜態(tài)吸附試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示,隨著溶液初始濃度的增加,MIM和NIM的吸附量都逐漸增加,在溶液初始濃度大于200 μg/L 后吸附量趨于飽和。MIM達(dá)到飽和吸附時(shí)的吸附容量為600.01 ng/cm2, NIM在達(dá)到飽和吸附時(shí)的吸附容量為235.18 ng/cm2,可以看到MIM的吸附量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于NIM的吸附量,這是由于MIM上存在特異性孔穴,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)丙沙星的特異性吸附。

另一方面我們著重培養(yǎng)幼兒的聽(tīng)記能力。在幼兒園日?；顒?dòng)中，我們有意識(shí)地借助現(xiàn)代教學(xué)媒體播放聲音文件，讓幼兒進(jìn)行故事內(nèi)容聽(tīng)記。為了讓幼兒能夠準(zhǔn)確記住聲音信息，我們引導(dǎo)幼兒把機(jī)械聽(tīng)記轉(zhuǎn)變成有意聽(tīng)記，也就是讓幼兒邊聽(tīng)聲音邊看多媒體展示的圖像或視頻，或者讓幼兒邊聽(tīng)邊按照聲音內(nèi)容做出相應(yīng)的動(dòng)作，或者讓幼兒把聽(tīng)到的聲音和看到的圖像概括性記憶，或者讓幼兒用繪畫(huà)等方式把聽(tīng)到的聲音信息表現(xiàn)出來(lái)。總之，通過(guò)不同的形式，把原本抽象的聲音轉(zhuǎn)換成較為具體的動(dòng)作、畫(huà)面，在這個(gè)基礎(chǔ)上再變成字詞的語(yǔ)言表達(dá)，不僅易于幼兒理解，同時(shí)也強(qiáng)化了幼兒的語(yǔ)言記憶能力，提高聽(tīng)記能力。

2.2.2 選擇性吸附試驗(yàn)

MIM及NIM對(duì)200 μg/L 環(huán)丙沙星及其結(jié)構(gòu)類似物氧氟沙星以及競(jìng)爭(zhēng)物頭孢羥氨芐、磺胺嘧啶、阿奇霉素200 μg/L 混合抗生素溶液的吸附結(jié)果見(jiàn)表2。其中,Qe和Kd代表了MIM和NIM的吸附能力和吸附效率,可以看到,MIM對(duì)CIP的吸附量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于NIM,但對(duì)于其他競(jìng)爭(zhēng)性抗生素來(lái)說(shuō),MIM和NIM的吸附量沒(méi)有明顯區(qū)別,而且MIM對(duì)CIP的吸附量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于MIM對(duì)OFL、CFR、SDZ、AZI等其他抗生素的吸附量,說(shuō)明MIM對(duì)CIP的吸附能力和吸附效率較好,這主要是由于MIM表面交聯(lián)的分子印跡聚合物涂層具有與CIP結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的空腔,可實(shí)現(xiàn)對(duì)CIP的特異性吸附。另外,選擇因子k是評(píng)價(jià)MIM對(duì)CIP與相關(guān)抗生素特異選擇性的一個(gè)指標(biāo)?？梢钥吹?MIM對(duì)CIP的吸附效率為OFL的2.19倍,是CFR的1.94倍,SDZ的19.84倍,AZI的30.03倍。這表明,與其他競(jìng)爭(zhēng)抗生素相比,MIM對(duì)CIP有更高的親和力。此外,相對(duì)選擇性系數(shù)k′可以用來(lái)評(píng)價(jià)MIM和NIM對(duì)同種抗生素的選擇性差異,通過(guò)結(jié)果看到,CIP的k′值為3.06,而其他競(jìng)爭(zhēng)抗生素的k′值約為1,進(jìn)一步證實(shí)了MIM對(duì)CIP的特異吸附性能?？偠灾?上述所有參數(shù)(Qe、Kd、k、k′)都在一定程度上說(shuō)明:通過(guò)分子印跡作用,在PVDF膜表面形成了具有特定形狀和大小的印跡孔穴和特異性結(jié)合位點(diǎn),表現(xiàn)出對(duì)CIP獨(dú)特的選擇性吸附能力。

表 2 MIM和NIM對(duì)不同抗生素的競(jìng)爭(zhēng)性吸附試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 2 Competitive adsorption test results for MIM and NIM on different antibiotics (n=3)

*Qe=(C0-Ce)×V/A;Kd=(C0-Ce)×V/(Ce×A)=Qe/Ce;k=Kd(CIP)/Kd(others);k′=kMIM/kNIM.Qe: equilibrium adsorption capacity;C0: initial concentration;Ce: equilibrium concentration;V: volume of the initial solution;A: area of MIM & NIM.

2.3 MIM萃取條件優(yōu)化

以100 μg/L 的環(huán)丙沙星加標(biāo)牛奶樣品的回收率為指標(biāo),考察MIM萃取時(shí)樣品溶液的樣品量、清洗劑種類、洗脫劑的種類及用量等參數(shù)。

2.3.1 樣品量

考察了25、50、75、100、125 μL樣品量對(duì)吸附量的影響,平行做3份,以1.6節(jié)的萃取步驟檢測(cè)平均回收率。結(jié)果如圖4a所示,當(dāng)樣品量小于50 μL時(shí),環(huán)丙沙星的回收率隨著樣品量的增加而增加,但當(dāng)樣品量大于50 μL時(shí),環(huán)丙沙星的回收率隨著樣品量的增加而降低,這可能是由于當(dāng)樣品量小于50 μL時(shí),MIM吸附未達(dá)到飽和,而當(dāng)樣品量大于50 μL時(shí),樣品基質(zhì)過(guò)多,有限的清洗劑不足以洗掉共提物,可能會(huì)占據(jù)一些環(huán)丙沙星的位點(diǎn),導(dǎo)致環(huán)丙沙星的吸附量反而減少。因此,樣品量確定為50 μL,在達(dá)到最大的環(huán)丙沙星吸附量的同時(shí),基質(zhì)的干擾作用最小。

2.3.2 清洗劑的種類

清洗劑的作用是洗去MIM的非特異性吸附物質(zhì),清洗劑的種類取決于雜質(zhì)的種類以及膜對(duì)目標(biāo)物的吸附強(qiáng)度。按照1.6節(jié)的萃取步驟,考察了超純水、乙腈、丙酮、甲醇4種不同的清洗溶劑,結(jié)果如圖4b所示,使用超純水作為清洗劑,可以得到最高的回收率(>95% ),以丙酮為清洗劑時(shí),回收率最低,僅為22% 。使用甲醇和乙腈作清洗劑時(shí),回收率也下降到33%左右。因此,我們選用超純水作為清洗劑,既能有效洗脫掉雜質(zhì),又不影響MIM對(duì)環(huán)丙沙星的吸附能力。

2.3.3 洗脫劑的種類

洗脫劑的作用是洗去MIM上特異性吸附的環(huán)丙沙星,破壞環(huán)丙沙星與分子印跡聚合物形成的氫鍵?？疾炝艘掖?乙酸(9∶1, v/v)、甲醇-乙酸(9∶1, v/v)、丙酮-乙酸(9∶1, v/v)、乙腈-乙酸(9∶1, v/v)對(duì)回收率的影響,結(jié)果(見(jiàn)圖4c)表明,用甲醇-乙酸(9∶1, v/v)作洗脫液時(shí),環(huán)丙沙星的回收率可以達(dá)到97%左右;使用乙醇-乙酸(9∶1, v/v)作洗脫劑時(shí),回收率最低,僅有14.7% ;使用丙酮-乙酸(9∶1, v/v)和乙腈-乙酸(9∶1, v/v)作洗脫劑時(shí),由于洗脫強(qiáng)度過(guò)大,可能會(huì)把一些其他干擾物及雜質(zhì)同時(shí)洗脫下來(lái),導(dǎo)致總離子流質(zhì)譜圖峰形變化,回收率不可靠,大于120% 。因此,我們選用甲醇-乙酸(9∶1, v/v)作洗脫劑,回收率穩(wěn)定可靠。

2.3.4 洗脫劑的用量

洗脫劑的用量決定了是否能把吸附在MIM上的環(huán)丙沙星完全洗脫掉,直接影響回收率。在上述優(yōu)化條件下,以甲醇-乙酸(9∶1, v/v)作為洗脫液,考察了不同用量(1、2、3、4、5 mL)對(duì)回收率的影響,結(jié)果如圖4d所示,當(dāng)洗脫劑用量較少(1 mL、2 mL)時(shí),回收率較低,分別為43.2%和55.2% ,當(dāng)洗脫劑用量大于等于3 mL時(shí),回收率較高,大于92% ,表明環(huán)丙沙星已基本從MIM上洗脫下來(lái)。因此,我們選擇3 mL甲醇-乙酸(9∶1, v/v)作為最優(yōu)洗脫條件。

圖 4 不同萃取條件對(duì)環(huán)丙沙星洗脫回收率的影響(n=3)Fig. 4 Effect of different extraction conditions of on elution recovery of ciprofloxacin (n=3)a. loading volume; b. washing agents; c. eluent; d. eluent dosage.

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與定量限(LOQ)

按照1.3節(jié)所述步驟配制環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照1.2節(jié)方法檢測(cè),得到以環(huán)丙沙星峰面積(A)對(duì)其質(zhì)量濃度(C)的線性回歸方程A=1.58×105C+6 859.21(r2=0.999 6),并做峰面積與質(zhì)量濃度的回歸標(biāo)準(zhǔn)殘差分析圖,具體標(biāo)準(zhǔn)殘差在-2～2之間分布,證明在0.1～200 μg/L 內(nèi)線性良好。采用稀釋法,以3倍和10倍信噪比確定方法的LOD和LOQ,得到環(huán)丙沙星的LOD和LOQ分別為0.02 μg/L 和0.1 μg/L。

2.4.2 準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度通過(guò)加標(biāo)回收率試驗(yàn)來(lái)考察。在空白牛奶基質(zhì)中添加不同水平的環(huán)丙沙星(10、50、100 ng/g),每個(gè)濃度水平平行測(cè)定3次,按照上述1.6節(jié)步驟處理后,進(jìn)行HPLC-MS/MS檢測(cè),代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算環(huán)丙沙星的濃度,并與實(shí)際加入量比較,求得各濃度水平下的回收率。結(jié)果如表3所示,加標(biāo)回收率在92.6% ～119.1%之間,表明準(zhǔn)確度良好。

2.4.3 精密度

制備含不同量環(huán)丙沙星(10、50、100 ng/g)的空白牛奶樣品,每個(gè)水平做5個(gè)平行樣品,按照上述1.6節(jié)步驟處理后,洗脫液進(jìn)行HPLC-MS/MS檢測(cè),連續(xù)測(cè)定3天,計(jì)算得到日內(nèi)精密度和日間精密度。結(jié)果如表3所示,可以看到日內(nèi)精密度在4.8% ～7.9%之間,日間精密度在3.3% ～7.7%之間,表明精密度良好。

表 3 CIP在牛奶樣品中3種不同加標(biāo)濃度下的回收率及其RSDTable 3 Recovery and RSDs of CIP spiked in milk sample at three spiked levels

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

從當(dāng)?shù)爻惺占?種不同品牌的牛奶樣品并進(jìn)行了分析,在這些牛奶樣品中均未檢測(cè)到CIP殘留。

3 結(jié)論

本研究制備了一種恩諾沙星分子印跡膜,該MIM對(duì)環(huán)丙沙星顯示出良好的選擇性及較高的吸附能力,因此可將其用于牛奶樣品中環(huán)丙沙星的提取和富集。實(shí)驗(yàn)結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)了食品基質(zhì)中痕量環(huán)丙沙星的快速檢測(cè),前處理簡(jiǎn)單,準(zhǔn)確度及精密度良好?？梢酝茰y(cè)，通過(guò)制備特定種類的不同分子印跡膜，能夠?qū)崿F(xiàn)食品中不同非法添加物的檢測(cè)，為食品安全監(jiān)管檢測(cè)提供新的思路。