宿書芳, 孫立臻, 薛 霞, 公丕學, 魏莉莉, 李新玲, 祝建華, 劉艷明*, 張 峰

(1. 山東省食品藥品檢驗研究院， 山東 濟南 250101; 2. 中國檢驗檢疫科學研究院食品安全所, 北京 100123)

地西泮(diazepam, C16H13ClN2O)又名安定,屬于苯二氮卓類鎮(zhèn)靜劑,具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥等作用(其結(jié)構(gòu)式見圖1)，畜牧生產(chǎn)中經(jīng)常被用作動物生長促進劑,以達到鎮(zhèn)靜催眠、促進生長和增重催肥的目的。近年來,一些不法商販擅自在水產(chǎn)動物捕撈和運輸過程中非法使用地西泮,導致其在水產(chǎn)品中殘留,人體長期攝入這類水產(chǎn)品,中樞神經(jīng)系統(tǒng)會受到嚴重干擾。因此鎮(zhèn)靜劑類藥物被許多國家列為水產(chǎn)動物捕撈和運輸過程中禁用藥物。我國農(nóng)業(yè)部235號公告已明確規(guī)定在動物性食品中不得檢出地西泮;農(nóng)業(yè)部176號公告也規(guī)定嚴禁在飼料和動物飲用水中使用地西泮等精神類藥物。

圖 1 地西泮的化學結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structure of diazepam

目前關(guān)于地西泮的研究報道大多集中在畜肉[1-5]、飼料[6,7]、保健食品[8]和血液、尿液等生物制品[9,10],也有少數(shù)學者對水產(chǎn)品中鎮(zhèn)靜劑進行研究[11-13]。報道的主要檢測方法有液相色譜法[14,15]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[16-20]和氣相色譜-質(zhì)譜法[5,21]等。其中,液相色譜法靈敏度相對較低,難以滿足禁用物質(zhì)的檢測要求;氣相色譜-質(zhì)譜法一般需要衍生,前處理過程復雜;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其具有較高的靈敏度,抗干擾能力強及不需要衍生等優(yōu)點,在獸藥殘留分析中應用最為廣泛?，F(xiàn)行標準[22]是唯一可適用于水產(chǎn)品中地西泮的檢測標準,但實際檢測過程中發(fā)現(xiàn),該方法存在回收率低、重現(xiàn)性差等問題。因此建立水產(chǎn)品中地西泮精準、高效的檢測方法意義重大。

水產(chǎn)品富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸等多種營養(yǎng)成分,基質(zhì)復雜,地西泮在水產(chǎn)品中是否與組織結(jié)合目前尚存在爭議[12,13,23]。選擇高效提取、凈化的技術(shù),是實現(xiàn)痕量殘留物有效提取與精準定量的前提。常見前處理技術(shù)有酶解、萃取等,采用的凈化方式有固相萃取[16,17,24]和QuEChERS[3,11,20,25]凈化。除了QuEChERS,傳統(tǒng)固相萃取凈化均需經(jīng)過活化-上樣-淋洗-洗脫-氮吹等步驟,實驗操作繁瑣耗時。Prime HLB固相萃取柱是新一代的通過式固相萃取吸附劑[26-28],其特有的親脂基團可以有效地吸附水產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)和磷脂類物質(zhì),較以往固相萃取劑具有更簡單、更高效、更潔凈的優(yōu)勢。

本研究比較了地西泮在水產(chǎn)品中的存在形式、提取條件,考察了采用Prime HLB固相萃取與QuEChERS兩種凈化方式的凈化效果,建立了以乙腈直接提取,Prime HLB固相萃取凈化,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測水產(chǎn)品中地西泮的測定方法。該方法試劑用量少,檢測周期短,準確度高,能滿足批量水產(chǎn)品中地西泮的快速準確檢測需求。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀,具有電噴霧電離(ESI)源(AB Sciex 5500,美國AB Sciex公司);超高效液相色譜儀(AQUITY UPLC I-Class)、Prime HLB凈化柱(60 mg/3 mL和200 mg/3 mL)、QuEChERS凈化管(含900 mg MgSO4、150 mgN-丙基乙二胺(PSA)、150 mg C18)(美國Waters公司);去離子水發(fā)生器(IQ 7000,美國Millipore公司);氮氣吹干儀(N-EVAP48,美國Orangaomation公司);離心機(3-18K,德國Sigma公司);渦旋混合器(MS3,德國IKA公司);針式濾器(有機相,0.22 μm,上海安譜實驗科技股份有限公司)。

地西泮(1 mg/mL, CAS號:439-14-5)購自美國Sigma-Aldrich公司。乙腈(色譜純,美國Merck公司);甲酸(色譜純,美國Fisher Scientific公司),β-葡萄糖醛酸苷酶(活度>100 000 U/mL,上海安譜有限公司);乙酸、乙酸鈉、氫氧化鈉(分析純,國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 標準溶液的配制

移取地西泮標準物質(zhì)1.00 mL,置于10 mL容量瓶中,用乙腈稀釋并定容至刻度,配制質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的標準儲備液,于4 ℃避光保存。移取適量標準儲備液,用乙腈逐級稀釋,配制成質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1.0、2.5、5.0和10 ng/mL 的標準工作溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取

直接提取:準確稱取均質(zhì)后的試樣2.0 g(精確至0.01 g),置于50 mL具塞離心管中,加入10 mL乙腈,渦旋混勻30 s后,超聲提取15 min,以 8 000 r/min 離心5 min,上清液待凈化。

酶解提取:準確稱取均質(zhì)后的試樣2.0 g(精確至0.01 g),置于50 mL具塞離心管中,加入10 mL乙酸鈉緩沖溶液(0.2 mol/L,用乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.2),渦旋混勻30 s后,加入β-葡萄糖醛酸苷酶50 μL,渦旋混勻,于37 ℃酶解過夜,然后取出冷卻至室溫,加入10 mL乙腈,渦旋混勻30 s后,超聲提取15 min,以 8 000 r/min 離心5 min,取上層清液待凈化。

1.3.2 凈化

Prime HLB固相萃取凈化:取待凈化液3 mL,注入Prime HLB固相萃取柱,調(diào)節(jié)流速1滴/s,使樣品溶液緩慢通過固相萃取柱,同時收集樣品凈化液于15 mL刻度離心管中,抽至近干后,濾液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,待進樣分析。

QuEChERS凈化:將待凈化液加入QuEChERS凈化管中,高速渦旋1 min,以 8 000 r/min 離心5 min,上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,待進樣分析。

1.4 分析條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱:Acquity UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫:35 ℃;流動相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液;流動相B:甲醇;流速:0.3 mL/min。梯度洗脫程序:0～1.0 min, 40%B; 1.0～6.0 min, 40%B～90%B; 6.0～8.0 min, 90%B; 8.0～8.1 min, 90%B～40%B; 8.1～10.0 min, 40%B。進樣量:3 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源:ESI源,正離子模式;檢測方式:多反應監(jiān)測(MRM)模式;電噴霧電壓:5.0 kV;脫溶劑氣溫度:450 ℃;氣簾氣壓力:241 kPa;霧化氣壓力:345 kPa;輔助霧化氣:275 kPa;碰撞氣壓力:55 kPa。地西泮的監(jiān)測離子對、去簇電壓(DP)及碰撞能量見表1。

表 1 地西泮的母離子、子離子及其他質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Precursor ion, daughter ion and other MS parameters of diazepam

*Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件

將1 μg/mL 地西泮標準溶液以流動注射方式注入質(zhì)譜儀,在正離子模式下進行一級質(zhì)譜全掃描,確定其分子離子峰;以地西泮分子離子峰為母離子,對獲得的母離子進行二級質(zhì)譜掃描,確定目標物的主要離子碎片,選擇相對豐度強、干擾小的離子對,通過優(yōu)化碰撞能,確定最佳質(zhì)譜條件(見表1)。

圖 2 地西泮標準溶液(1 ng/mL)的提取離子流色譜圖Fig. 2 Extracted ion current chromatograms of diazepam in the standard solution (1 ng/mL)

2.1.2 流動相條件

地西泮分子結(jié)構(gòu)中含有兩個苯環(huán)和一個七元雜環(huán)(見圖1),在C18色譜柱上保留較強。因此,色譜洗脫過程中,極易與基質(zhì)中非極性組分共流出,導致色譜峰形較差或干擾嚴重。選擇適宜的流動相能很大程度上降低基質(zhì)干擾,提高方法的準確性。本實驗考察了甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液和乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液分別作為流動相時,目標物與雜質(zhì)的分離情況。經(jīng)比較,采用甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液為流動相時可獲得理想的色譜峰形和保留行為,且能與基質(zhì)中干擾組分有效地分離,提高了方法的靈敏度,更適合于低含量水平地西泮的定性定量分析。地西泮標準溶液(1 ng/mL)的提取離子流色譜圖見圖2。

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取方式的選擇

為充分提取基質(zhì)中的目標化合物,本文首先以地西泮陽性樣品為例,比較了直接提取與酶解處理兩種前處理方式對測量結(jié)果的影響。結(jié)果顯示,經(jīng)過酶解處理后,目標物測得的平均值為1.17 μg/kg(n=6),而未經(jīng)酶解樣品的測定平均值為1.25 μg/kg(n=6),略高于經(jīng)酶解處理的樣品;其次以空白加標樣品為例,比較是否酶解對目標化合物回收率的影響(見表2)。結(jié)果顯示,水產(chǎn)品經(jīng)酶解處理后,地西泮回收率低于直接提取過程?？赡苁怯捎诿附夂?基質(zhì)中小分子化合物增多,目標物基質(zhì)抑制作用增強,造成實測濃度降低。以上研究表明,水產(chǎn)品基質(zhì)中，地西泮以游離形式存在，測定時無需進行酶解處理。

表 2 采用不同提取方式時地西泮的回收率(n=6)Table 2 Recoveries of diazepam using different extraction methods (n=6)

圖 3 不同提取劑對地西泮回收率的影響Fig. 3 Effect of different extraction solvents on the recoveries of diazepamSolvent 1: acetonitrile; solvent 2: acetonitrile (containing 1% (v/v) acetic acid); solvent 3: acetonitrile (containing 1% (v/v) ammonium hydroxide); solvent 4: ethyl acetate.

2.2.2 樣品提取劑的選擇

地西泮溶于乙腈、乙酸乙酯等有機溶劑。實驗以黃花魚和明蝦樣品為例,比較了乙腈[2]、1%(v/v)乙酸乙腈[7]、1%(v/v)氨水乙腈[13]和乙酸乙酯[25]4種提取劑的提取效率(見圖3)。實驗發(fā)現(xiàn),以乙酸乙酯為提取劑,樣品提取溶液較渾濁,乳化現(xiàn)象嚴重,導致回收率低;采用1%乙酸乙腈和1%氨水乙腈為提取劑時的提取效率與純乙腈的提取效率均在85%以上,無明顯差異。綜合考慮,本方法選擇乙腈作為提取劑。

2.2.3 凈化方式的選擇

選取空白水產(chǎn)品樣品,加入一定濃度的地西泮標準物質(zhì),經(jīng)乙腈提取后,上機分析,計算目標物的回收率為155% ～188% ,呈現(xiàn)較強的基質(zhì)增強效應,因此必須采取合理的凈化方式,以降低基質(zhì)效應(ME)的影響。本研究采用通過式固相萃取柱(Prime HLB),僅需樣液上柱,無需活化、淋洗、洗脫等步驟,操作更快捷方便,且Prime HLB固相萃取柱填料因鍵合特有親脂基團,能有效吸附水產(chǎn)品基質(zhì)中的磷脂、脂肪、蛋白質(zhì)等干擾物,從而實現(xiàn)樣品凈化目的。

為驗證方法優(yōu)越性,以不同水產(chǎn)品為研究對象,將采用Prime HLB柱(6 mg/3 mL)的凈化方式與QuEChERS凈化方式的凈化效果進行了比較,以基質(zhì)效應的大小進行表征。其中,基質(zhì)效應的計算公式為ME=(基質(zhì)匹配標準溶液曲線斜率/無基質(zhì)標準溶液曲線斜率-1)×100% 。ME絕對值越大表明基質(zhì)效應越強[23]。結(jié)果顯示,經(jīng)Prime HLB柱凈化后,地西泮的基質(zhì)效應明顯低于QuEChERS凈化(見表3)。

表 3 采用不同凈化方式時地西泮的基質(zhì)效應Table 3 Matrix effects of diazepam using different purification methods

2.2.4 不同規(guī)格SPE的選擇

為獲得最佳的回收率與凈化效果,比較了兩種規(guī)格(60 mg/3 mL和200 mg/6 mL)的凈化柱對不同水產(chǎn)品的凈化情況。結(jié)果如圖4所示,當上樣體積為3 mL時,采用含60 mg填料的凈化柱,地西泮的回收率要優(yōu)于含200 mg填料的凈化柱?？赡苁怯捎诤?00 mg填料的固相萃取柱對地西泮有部分吸附;當上樣體積增大至5 mL,采用含200 mg填料凈化柱的回收率明顯提高。綜合考慮回收率、實驗成本、檢測效率等因素,最終選擇填料為60 mg規(guī)格的Prime HLB固相萃取柱進行凈化,上樣體積為3 mL。

圖 4 不同規(guī)格凈化柱對地西泮回收率的影響Fig. 4 Effect of purification columns with different specifications on the recoveries of diazepam

2.2.5 SPE上樣溶液的選擇

Prime HLB固相萃取柱為通量型固相萃取柱,實際應用時多采用乙腈-水[26-28]作為上樣溶劑。本研究選取不同體積分數(shù)的乙腈水溶液為試劑空白,并分別加入1.0 μg/mL 的地西泮標準溶液50 μL,并以此為研究對象,考察上樣溶液中乙腈的體積分數(shù)對地西泮回收率的影響。如圖5所示,隨著乙腈體積分數(shù)的增大,目標物的回收率逐漸升高,當采用純乙腈上樣時,目標物的回收率接近100% 。因此本研究樣品提取液無需用水稀釋,可直接上樣。

圖 5 上樣溶液中乙腈的體積分數(shù)對地西泮回收率的影響Fig. 5 Effect of volume fractions of acetonitrile on the recoveries of diazepam in sample loading solutions

圖 6 氮吹對不同樣品中目標物回收率的影響(n=3)Fig. 6 Effect of the nitrogen blowing on the recoveries of the different samples (n=3)

2.2.6 濃縮過程的考察

氮吹濃縮是獸殘分析過程中常用的濃縮方式,經(jīng)過濃縮,大部分分析物的靈敏度得到提高,對于痕量殘留分析測定,濃縮步驟更是不可或缺。本研究分別以地西泮標準溶液、空白加標樣品及地西泮陽性樣品為例,考察氮吹濃縮前后地西泮響應值的變化情況。由圖6可以看出,經(jīng)氮吹后,目標物響應值均有不同程度的降低。其中,標準溶液中目標物響應降低的最多,損失約為70% ;空白加標樣品及地西泮陽性樣品中目標物響應降低程度為30% ～45% 。

為進一步確定氮吹濃縮過程目標物損失的原因,實驗以標準溶液(5 ng/mL)氮吹為例,考察了加熱溫度(30、40和50 ℃)對目標物的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)不同溫度氮吹后,目標物的響應值無明顯差異。因此,溫度不是影響回收率降低的原因,可能的原因是氮吹過程目標物發(fā)生了變化或損失。兼顧方法的靈敏度與準確性,本方法不采用氮吹富集。

2.3 基質(zhì)效應

采用2.2.3節(jié)描述對基質(zhì)效應進行評價,以海水魚、淡水魚、海水蝦等不同水產(chǎn)品為研究對象,評價不同樣品的基質(zhì)效應,結(jié)果見表3。由表3可見,不同魚之間基質(zhì)效應為3.9% ～7.6% ,不同蝦之間基質(zhì)效應為5.5% ～10.1% ,各水產(chǎn)品間基質(zhì)效應差異不大,可采用外標法定量。為避免不同水產(chǎn)品含水量對測試樣本最終體積的影響,本研究采用基質(zhì)匹配標準曲線外標法進行定量分析。

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性關(guān)系和檢出限

稱取一定量的空白基質(zhì),加入一定體積的標準工作液,按1.3節(jié)最優(yōu)的前處理條件進行提取、凈化,制備質(zhì)量濃度依次為0.1、0.5、1.0、2.5、5和10 ng/mL 的基質(zhì)標準工作溶液,按濃度由低到高進行測定。以目標物峰面積為縱坐標(Y),對應的質(zhì)量濃度值為橫坐標(X, ng/mL),繪制標準曲線,其線性方程及相關(guān)系數(shù)(r2)見表4?？梢钥闯?對于不同水產(chǎn)品基質(zhì),在0.1～10 ng/mL 濃度范圍內(nèi),均能呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,其相關(guān)系數(shù)均大于0.99。以3倍和10倍信噪比確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),分別為0.5 μg/kg 和1.5 μg/kg。

表 4 地西泮的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 4 Linear equations, correlation coefficients(r2), LODs and LOQs of diazepam

Y: peak area;X: mass concentration, ng/mL.

2.4.2 回收率與精密度

選取空白黃花魚和蝦樣品,分別加入一定體積的地西泮標準溶液,添加含量依次為1.5、3.0和15.0 μg/kg,每個水平平行測定6次,計算添加回收率及方法日內(nèi)精密度;按相同的樣品處理方式,連續(xù)測定6 d,計算6 d內(nèi)每個水平測得值的相對標準偏差,作為方法的日間精密度。結(jié)果如表5所示,3個水平下,地西泮的加標回收率為88.2% ～101.1% ,日內(nèi)及日間精密度均小于10% 。表明該方法準確度高,重復性好,可滿足水產(chǎn)品中地西泮殘留定量的檢測需求。

表 5 水產(chǎn)品中地西泮的回收率及精密度(n=6)Table 5 Recoveries and precisions of diazepam in aquatic products (n=6)

2.5 實際樣品測定

應用所建立的方法對市售100批次水產(chǎn)品樣品進行檢測,有3批次黑魚樣品檢出地西泮,檢出值為1.7～4.0 μg/kg, 1批次鯉魚樣品檢出,檢出值為8.9 μg/kg,海水蝦等其他樣品未檢出地西泮。

3 結(jié)論

本文建立了通過式固相萃取凈化-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測水產(chǎn)品中地西泮殘留量的分析方法,并對提取溶劑、凈化條件、濃縮方式、基質(zhì)效應等關(guān)鍵因素進行了考察與評價。該方法前處理簡便、經(jīng)濟、高效,且實用性強,可滿足大批量樣品的快速測定。本方法的建立可為水產(chǎn)品中地西泮的測定提供一種新選擇,為水產(chǎn)品中地西泮檢測標準的修訂提供技術(shù)參考,同時為檢驗機構(gòu)日常檢測及政府質(zhì)量監(jiān)管提供技術(shù)保障。