趙慧男, 張艷俠, 薛 霞, 戴 琨, 鄭文靜, 馬 騁, 祝建華, 劉艷明*, 張 峰

(1. 山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院, 山東 濟(jì)南 250101; 2. 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院, 北京 100176)

食品中的抗氧化劑是能夠防止或延緩食品氧化性和延長儲(chǔ)存期的食品添加劑,主要用于防止油脂和富脂食品的氧化酸敗,以及由氧化所導(dǎo)致的褪色、褐變、維生素破壞等,分為天然和人工合成兩大類。人工合成抗氧化劑因價(jià)格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定而被廣泛使用,較常用的人工合成抗氧化劑有叔丁基對(duì)羥基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)、特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)、2,4,5-三羥基苯丁酮(THBP)、2,6-二叔丁基-4-羥甲基苯酚(Ionox-100)、沒食子酸丙酯(PG)、沒食子酸辛酯(OG)、沒食子酸十二酯(DG)、正二氫愈創(chuàng)木酸(NDGA)等,此類化合物為苯酚類抗氧化劑[1-3]。研究表明,高劑量使用此類人工合成抗氧化劑會(huì)造成細(xì)胞凋亡、DNA裂解等潛在健康危害,其具有一定的毒性和致癌作用[4,5]。因此,美國、日本、歐盟等國家和地區(qū)已禁止使用一些合成抗氧化劑。植物油是日常生活中必不可少的食品,我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)PG、BHA、BHT、TBHQ等抗氧化劑在油脂中的最大使用量也做出了嚴(yán)格規(guī)定[6],規(guī)定BHA、BHT和TBHQ的最大使用限量為0.2 g/kg, PG的最大使用限量為0.1 g/kg,對(duì)THBP、OG、DG、NDGA、Ionox-100等其他抗氧化劑暫無規(guī)定。

目前針對(duì)BHA、TBHQ、PG等抗氧化劑的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法[7]、比色法[7]、氣相色譜法(GC)[7,8]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS)[9,10]、高效液相色譜法(HPLC)[11-13]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS)[14]。其中,薄層色譜法和比色法在定量方面存在缺陷。氣相色譜法和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法常受到化合物極性、沸點(diǎn)等限制,且前處理方法相對(duì)復(fù)雜、耗時(shí)長。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法易受基質(zhì)效應(yīng)影響,定量存在局限性,且液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀器昂貴,設(shè)備普及率低,限制了此方法的應(yīng)用。高效液相色譜法具有普及率高、定量準(zhǔn)確、兼容性好等特點(diǎn),現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中9種抗氧化劑的測(cè)定》[15]包含高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜法以及氣相色譜-質(zhì)譜法和比色法,其中僅高效液相色譜法適用于PG、THBP、TBHQ等9種目標(biāo)抗氧化劑的同時(shí)檢測(cè)。國標(biāo)方法前處理采用正己烷溶解樣品,再用乙腈進(jìn)行萃取,C18固相萃取柱凈化,整個(gè)過程繁瑣,耗時(shí)較長。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),該方法回收率較低,且實(shí)驗(yàn)過程中未加入保護(hù)劑,可能導(dǎo)致部分目標(biāo)物損失,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

針對(duì)抗氧化劑檢測(cè)過程中存在的問題,本文對(duì)目標(biāo)物穩(wěn)定性進(jìn)行考察,確定標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的儲(chǔ)存條件,通過添加抗壞血酸棕櫚酸酯(AP)的方式,提高目標(biāo)物穩(wěn)定性和回收率;對(duì)提取溶劑、除脂方式以及凈化方式等進(jìn)行討論,最終建立了一種快速、簡便、準(zhǔn)確的高效液相色譜測(cè)定食用油中9種常用人工合成抗氧化劑的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Thermo Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司); AB204-S型電子天平(瑞士Mettler Toledo公司); SB-800DTD型超聲波清洗器(中國寧波新芝生物科技股份有限公司); 3-18K型冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司); Milli-Q純水系統(tǒng)(美國Millipore公司); MS3渦旋混合器(德國IKA公司)。

TBHQ、THBP、BHT、BHA、OG、NDGA、Ionox-100、DG均購自北京曼哈格生物科技有限公司,純度≥98% , PG購自德國Dr. Ehrenstorfer公司,純度≥95% 。甲醇、乙腈(HPLC級(jí))購自德國Merck公司,純度>99.9% ; AP購自日本TCI公司,純度>97% 。實(shí)驗(yàn)所用花生油、玉米油、大豆油等植物油樣品均為市售。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取9種抗氧化劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10 mg(精確至0.1 mg),用甲醇溶解并定容至10 mL,分別配制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 mg/mL),置于棕色玻璃小瓶中,于-18 ℃冷凍保存。移取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用甲醇(含50 μg/mL AP)稀釋至適當(dāng)濃度,得到抗氧化劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,于-18 ℃冷凍保存。

1.2.2 樣品前處理

稱取2 g樣品(準(zhǔn)確至0.001 g),置于50 mL離心管中,加入10 mL甲醇,渦旋振蕩2 min,超聲提取20 min,以 8 000 r/min 離心5 min;用5 mL甲醇重復(fù)提取一次,合并上清液,于-18 ℃冷凍2 h除脂,用0.22 μm微孔濾膜過濾,待測(cè)。

1.2.3 色譜條件

色譜柱:Waters?XBridge色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫:35 ℃;流動(dòng)相:(A)甲醇和(B)0.1%(v/v)甲酸水溶液;流速:1.0 mL/min。梯度洗脫條件:0～5 min, 50%A; 5～15 min, 50%A～80%A; 15～20 min, 80%A; 20～25 min, 80%A～90%A; 25～27 min, 90%A～50%A; 27～30 min, 50%A。進(jìn)樣體積:5 μL;檢測(cè)波長:280 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗氧化劑儲(chǔ)存條件的優(yōu)化

在抗氧化劑檢測(cè)過程中,發(fā)現(xiàn)9種抗氧化劑混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于4 ℃冷藏儲(chǔ)存后,THBP和TBHQ響應(yīng)面積迅速降低,導(dǎo)致定量不準(zhǔn),嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí),這種現(xiàn)象也可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)前處理過程中THBP和TBHQ兩種物質(zhì)回收率失真,實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度降低。因此,本文研究了抗氧化劑儲(chǔ)存溫度,并通過在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制和前處理過程中添加其他抗氧化劑的方式增加目標(biāo)抗氧化劑穩(wěn)定性,保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.1.1 溫度對(duì)抗氧化劑的影響

用甲醇配制10 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別設(shè)置常溫、4 ℃和-18 ℃ 3種儲(chǔ)存溫度,連續(xù)測(cè)定144 h。結(jié)果顯示:PG、NDGA、BHA、Ionox-100、OG、BHT、DG等響應(yīng)強(qiáng)度在不同溫度下,不隨時(shí)間發(fā)生明顯變化,穩(wěn)定性較好。而THBP和TBHQ兩種物質(zhì)的響應(yīng)強(qiáng)度在常溫和4 ℃冷藏兩種儲(chǔ)存溫度下均發(fā)生不同程度的降低,-18 ℃冷凍時(shí)溶液中各成分含量穩(wěn)定,未發(fā)生明顯變化,其峰面積占0 h時(shí)峰面積的百分比如圖1所示,因此建議標(biāo)準(zhǔn)溶液于-18 ℃冷凍儲(chǔ)存。

圖 1 不同儲(chǔ)藏條件下THBP和TBHQ的含量變化Fig. 1 Changes of contents of THBP and TBHQ under different storage conditionsTHBP: 2′,4′,5′-trihydroxybutyrophenone; TBHQ: tert-butylhydroquinone.

2.1.2 AP對(duì)抗氧化劑的影響

9種目標(biāo)物均為合成酚類抗氧化劑,其抗氧化機(jī)理為吸收氧化產(chǎn)生的自由基,阻斷自由基鏈鎖反應(yīng),將油脂被氧化產(chǎn)生的自由基轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的產(chǎn)物,消除脂類氧化的自由基反應(yīng)[16]。AP是一種脂溶性營養(yǎng)性抗氧化劑,其在消除機(jī)體自由基的同時(shí),還能在金屬離子Ca2+、Fe3+等存在下,與O2反應(yīng)最終生成脫氫抗壞血酸,從而消除O2或H2O2對(duì)機(jī)體的氧化損害作用,可推測(cè)AP抗氧化能力比目標(biāo)物強(qiáng)。有文獻(xiàn)[17]報(bào)道AP在豬油中抗氧化能力優(yōu)于TBHQ,因此嘗試在配制溶液和提取溶液中加入AP,以改善標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)存和前處理過程中THBP和TBHQ的不穩(wěn)定。

圖 2 甲醇溶劑中AP的質(zhì)量濃度對(duì)THBP和TBHQ響應(yīng)強(qiáng)度的影響Fig. 2 Effect of mass concentrations of AP in methanol on the responses of the THBP and TBHQAP: ascorbyl palmitate.

圖 3 加入AP后9種抗氧化劑響應(yīng)強(qiáng)度的變化Fig. 3 Changes of intensities of the nine antioxidants after adding APPG: propyl gallate; NDGA: nordihydroguaiaretic acid; BHA: butylated hydroxyanisole; Ionox-100: 2,6-di-tert-butylphenol; OG: octyl gallate; BHT: butylated hydroxy toluene; DG: dodecyl gallate.

用含不同濃度AP的甲醇溶液配制9種抗氧化劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,常溫避光儲(chǔ)存,測(cè)定目標(biāo)抗氧化劑的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示:AP質(zhì)量濃度超過5 μg/mL 時(shí),8 h內(nèi)9種抗氧化劑含量基本穩(wěn)定,8 h后THBP和TBHQ兩種成分含量快速下降;當(dāng)AP濃度不低于50 μg/mL 時(shí),144 h內(nèi)THBP和TBHQ含量穩(wěn)定,其占0 h時(shí)峰面積的百分比見圖2。加入AP(50 μg/mL)后混合溶液中包括THBP和TBHQ在內(nèi)的9種成分在常溫儲(chǔ)存條件下144 h內(nèi)含量均穩(wěn)定,結(jié)果見圖3。因此,為保證實(shí)驗(yàn)過程中目標(biāo)物的回收率,在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制和實(shí)際樣品檢測(cè)過程中采用含50 μg/mL AP的甲醇溶液作為溶劑。

2.2 提取條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇和乙腈分別作為提取溶劑時(shí)目標(biāo)物的提取效率。當(dāng)提取體積為10 mL、提取1次時(shí),花生油樣品中9種抗氧化劑的回收率見圖4。結(jié)果顯示:甲醇提取目標(biāo)物時(shí)的回收率為76.4% ～93.4% ,乙腈提取時(shí)的回收率為65.0% ～89.0% ,甲醇的提取效率明顯高于乙腈。推測(cè)原因可能是:對(duì)于酚類化合物,質(zhì)子性溶劑有更好的提取效果,故選擇甲醇作為提取溶劑。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)提取次數(shù)進(jìn)行了考察,結(jié)果顯示,甲醇提取2次時(shí)的回收率范圍為90.1% ～102.6% ,繼續(xù)增加提取次數(shù),回收率無明顯提高,因此選擇提取2次。

圖 4 兩種提取溶劑對(duì)9種目標(biāo)化合物回收率的影響Fig. 4 Effects of two extraction solvents on the recoveries of the nine target compounds

2.3 凈化條件的優(yōu)化

2.3.1 除脂方式

參考文獻(xiàn)[13,18]方法,對(duì)于油脂樣品多利用正己烷或冷凍等方式脫脂,本文提取溶劑為甲醇,而正己烷能部分溶解于甲醇,因此不采用正己烷進(jìn)行脫脂。低溫條件下,植物油中部分雜質(zhì)和不飽和脂肪酸在甲醇中溶解度低,提取液經(jīng)冷凍后過濾,能夠去除部分雜質(zhì),有利于延長色譜柱使用壽命。實(shí)驗(yàn)證明,冷凍除脂前后,9種目標(biāo)抗氧化劑基本沒有損失,除脂后9種目標(biāo)物的回收率為90.5% ～103.1% ,因此選擇冷凍除脂。

2.3.2 固相萃取方式的優(yōu)化

植物油樣品中可能存在雜質(zhì),干擾目標(biāo)物的分離,本研究首先考慮采用固相萃取方式對(duì)植物油樣品進(jìn)行凈化,并通過此方式減少對(duì)色譜體系的污染。

現(xiàn)有文獻(xiàn)[19]研究中對(duì)于抗氧化劑的凈化多采用C18和HLB固相萃取柱,因此首先比較了上述兩種固相萃取柱凈化效果。結(jié)果顯示,抗氧化劑在C18固相萃取柱上保留較弱,9種抗氧化劑回收率均小于20% ,分析發(fā)現(xiàn),上樣過程中損失44.9% ～75.6%的目標(biāo)物。原因可能為抗氧化劑大多數(shù)是極性比較強(qiáng)的酚類化合物,而C18固相萃取柱以十八烷基硅膠為填料,通過強(qiáng)疏水作用保留非極性化合物,因此對(duì)目標(biāo)物保留較弱;HLB固相萃取柱凈化結(jié)果顯示,由于抗氧化劑結(jié)構(gòu)的差異性,不同抗氧化劑與HLB固相萃取柱作用能力不同,其中PG、THBP、NDGA、OG、DG回收率較好,超過66.7% , TBHQ、BHA、BHT、Ionox-100回收率僅為6.9% ～43.2% ,損失較多。

氨基柱具有較強(qiáng)的氫鍵結(jié)合能力,其正相萃取模式適用于吸附極性化合物,因此本研究后續(xù)嘗試用氨基柱對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行凈化,但結(jié)果仍不理想,僅BHA、BHT和Ionox-100回收率分別為57.0% 、31.3% 、84.8% ,氨基柱對(duì)其他目標(biāo)抗氧化劑保留較強(qiáng),無法洗脫下來。

研究發(fā)現(xiàn),C18、HLB和氨基柱3種固相萃取方式對(duì)9種目標(biāo)抗氧化劑同時(shí)凈化回收率均不理想。因此本研究不采用固相萃取凈化方式,選擇用甲醇提取目標(biāo)抗氧化劑,冷凍除脂凈化。多種植物油樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,此方法干擾較少,能夠滿足9種目標(biāo)化合物分離以及定量的需求。

2.4 色譜條件的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了Waters Symmetry Shield C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)、Waters XBridge C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)和Waters Atlantis T3(250 mm×4.6 mm, 5 μm)3種色譜柱對(duì)分離效果的影響。結(jié)果顯示,在相同的色譜條件下,Symmetry Shield C18色譜柱對(duì)目標(biāo)物不能很好地分離,而Atlantis T3對(duì)目標(biāo)物保留較強(qiáng),出峰時(shí)間較晚,導(dǎo)致分析時(shí)間延長。因此實(shí)驗(yàn)最終選擇XBridge C18色譜柱進(jìn)行分離。

表 1 9種抗氧化劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 1 Linear equations, correlation coefficients (R2), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of the nine antioxidants

Y: peak area;X: mass concentration, μg/mL.

本文對(duì)流動(dòng)相的水相進(jìn)行了優(yōu)化,考察了采用水、0.1%甲酸水溶液和0.5%甲酸水溶液時(shí)目標(biāo)物的分離情況。結(jié)果顯示:水相中不含甲酸,PG、THBP的峰形拖尾嚴(yán)重,不對(duì)稱度分別為2.61和2.84。在水相中加入甲酸后,能夠有效緩解拖尾情況,峰形得到改善,甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.1%和0.5%時(shí)峰形均較好,兩者響應(yīng)峰面積無明顯區(qū)別,考慮甲酸體積分?jǐn)?shù)過高會(huì)影響色譜柱壽命,因此選擇0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相水相。優(yōu)化條件后混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/mL)、空白花生油樣品和加標(biāo)花生油樣品(5 mg/kg)的色譜圖見圖5。

圖 5 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/mL)、空白花生油樣品和加標(biāo)花生油樣品(5 mg/kg)的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of mixed standard solution (10 μg/mL), blank peanut oil sample and peanut oil spiked sample (5 mg/kg)

2.5 線性范圍、相關(guān)系數(shù)及定量限

用甲醇(含50 μg/mL AP)逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,配制質(zhì)量濃度為0.1、0.5、2.0、5.0、10.0、25.0 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。將系列標(biāo)準(zhǔn)工作液按濃度從低到高的順序進(jìn)行測(cè)定,以抗氧化劑的峰面積(Y)對(duì)其質(zhì)量濃度(X, μg/mL)進(jìn)行線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用空白植物油樣品加標(biāo)的方法,以信噪比(S/N)=3和10時(shí)得到的目標(biāo)物含量分別定義檢出限和定量限,結(jié)果見表1。目標(biāo)化合物在0.1～25.0 μg/mL 之間線性關(guān)系良好,線性相關(guān)系數(shù)(R2)均在0.999以上。

2.6 回收率和精密度

向陰性樣品中添加低、中、高3個(gè)加標(biāo)水平的9種抗氧化劑,每個(gè)水平平行測(cè)定6次,得到方法的回收率及精密度,見表2。結(jié)果表明,9種抗氧化劑的加標(biāo)回收率為85.3% ～104.1% ,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3% ～5.0% 。

表 2 不同植物油中9種抗氧化劑的回收率及精密度(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs of the nine antioxidants in different vegetable oils (n=6)

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用本方法對(duì)市售的玉米油、調(diào)和油、花生油等20批次樣品進(jìn)行分析,檢測(cè)結(jié)果為兩批次胡麻油中Ionox-100有檢出,含量分別為3.08 mg/kg 和25.6 mg/kg;一批次牡丹籽油中BHT有檢出,含量為39.0 mg/kg;兩批次紫蘇油中NDGA有檢出,含量分別為6.53 mg/kg 和16.8 mg/kg,其他種類植物油中未檢出目標(biāo)化合物。

3 結(jié)論

本文在現(xiàn)有抗氧化劑研究基礎(chǔ)上,考察及比較了不同的提取溶劑、凈化方式及色譜條件,對(duì)植物油中9種抗氧化劑高效液相色譜法進(jìn)行了優(yōu)化。本文通過對(duì)抗氧化劑穩(wěn)定性的研究,確定標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的儲(chǔ)存條件,并通過在前處理過程中添加AP的方式,提高目標(biāo)物穩(wěn)定性和回收率,同時(shí)提出了一種快速、準(zhǔn)確檢測(cè)植物油中9種常用合成抗氧化劑的方法。該方法操作簡單,快捷、準(zhǔn)確,能夠縮短檢測(cè)時(shí)間,大大提高方法的回收率和準(zhǔn)確度,能夠更好地為植物油市場(chǎng)監(jiān)管提供服務(wù)。