王 龍 孫劍秋 金世宇

(1.中國科學(xué)院 微生物研究所真菌學(xué)國家重點實驗，北京 100101；2.紹興文理學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 紹興 312000；3.北京市京西林場，北京 102300)

0 引言

籃狀菌屬(Talaromyces)島籃狀菌組(sectionIslandici)的物種通常生長緩慢，形成絨狀菌落，并產(chǎn)生蒽醌類次級代謝產(chǎn)物，使得其菌絲呈現(xiàn)橙黃色.這些蒽醌類次級代謝產(chǎn)物通常具有動物毒性，屬于真菌毒素(mycotoxins).如T.islandicus(Sopp) Samson, N.Yilmaz, Frisvad & Seifert產(chǎn)生的islandicin, luteoskyrin, erythroskyrin, rugulosin，skyrin等真菌毒素具有肝臟和腎臟毒性并致癌.大米被T.islandicus污染會變成淺橙黃色，稱為黃變米，長期食用黃變米會導(dǎo)致肝癌[1].T.radicus(A.D.Hocking & Whitelaw) Samson，N.Yilmaz, Frisvad & Seifert，T.rugulosus(Thom) Samson，N.Yilmaz, Frisvad & Seifert和T.wortmannii(Kl?cker) C.R.Benj.主要產(chǎn)生rugulosin和skyrin.rugulosin具有抗金黃葡萄球菌活性[2, 3].有學(xué)者發(fā)現(xiàn)skyrin是一種非多肽類的小分子降血糖物質(zhì)[4]，但此后再也沒有相關(guān)的研究報道.T.rugulosus和T.wortmannii還可以產(chǎn)生多種酶類，如T.rugulosus可以產(chǎn)生蕓香苷酶(beta-rutinosidase)和磷酸酶(phoshatase)[5, 6].T.wortmannii可以產(chǎn)生尿烷酶(urethanase)降低尿烷的致癌風(fēng)險[7].另外，T.wortmannii在土壤中可以分泌揮發(fā)性有機物(volatile organic compounds，VOCs)，促進(jìn)植物種芽生長并增強抗病性[8].島籃狀菌組的種類是非常重要的生物資源，截止到2019年12月，全球該組共報報道了33個種，而我國只發(fā)現(xiàn)了8個種[9-12].本文報道該組的2個我國新記錄種，即安拉阿巴德籃狀菌(T.allahabadensis(B.S.Mehrotra & D.Kumar) Samson，N.Yilmaz & Frisvad)和鴿色籃狀菌(T.columbinesS.W.Peterson & Jurjevi?).

1 材料與方法

1.1 樣品采集和分離

土壤樣品采自我國青海省西寧市湟中縣塔爾寺和河南省洛陽龍門石窟荒野.樣品約25 g置于無菌的塑料袋中封好，記錄采集地、基物種類、采集日期、經(jīng)緯度和采集人信息.樣品分離采用Malloch[13]的倍比稀釋傾倒平皿法并做了改進(jìn)，即將樣品碾碎，取約1 g樣品放入裝有9 mL的無菌0.1%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)水溶液大試管(20×200 mm)中，蓋緊無菌硅橡膠試管塞，震蕩混勻成懸濁液，作為第一稀釋度10-1.然后迅速取該稀釋度的懸濁液1 mL倒入第二個同樣的大試管中搖勻，作為第二稀釋度，依此類推直到第四個稀釋度10-4.取最后2個連續(xù)的稀釋度的懸濁液約1 mL傾倒于事先倒好的馬丁培養(yǎng)基(DRBC，Dichloran rose bengal chloramphenicol)的平皿(規(guī)格90 mm)，用無菌涂布棒均勻涂布，于25 ℃倒置培養(yǎng).從第3天開始觀察并挑取單菌落轉(zhuǎn)接于麥芽精瓊脂(MEA)的小平皿(規(guī)格60 mm)，于25 ℃ 倒置培養(yǎng)7-14天，然后用封口膜封好，于4 ℃保存以待鑒定.分離得到的2株籃狀菌12260和14002保存于中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)，保藏號分別為AS 3.15811和AS 3.15848.

1.2 形態(tài)學(xué)方法

菌落顏色的描述參照Ridgway[14]的色譜.培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件為查氏酵母精瓊脂(CYA)25 °C、37 °C，MEA 25 °C，均培養(yǎng)7 d后觀察和描述.顯微結(jié)構(gòu)觀察：取在MEA上生長旺盛時的產(chǎn)分生孢子的結(jié)構(gòu)做載片觀察和描述.鑒定參考資料為Raper and Thom、Pitt、Yilmaz，et al的專著和論文[15-17].

1.3 PCR擴(kuò)增和測序

DNA的提取參考Wang and Zhuang[18].擴(kuò)增鈣調(diào)蛋白基因(calmodulin gene，CaM)的引物為AD1: 5′-gccgactctttgactgaagagc-3′和Q1: 5′-gcatcatgagctggacgaactc-3′[19]；擴(kuò)增rDNA ITS1-5.

8S-ITS2序列(ITS)引物選擇ITS5: 5′-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3′和ITS4: 5′-tcctccgcttattgatatgc-3′[20].PCR擴(kuò)增反應(yīng)在無菌的0.2 mL薄壁平蓋Eppendorf管中進(jìn)行，20 μL反應(yīng)體系含有基因組DNA 1.0 μL，正向和反向引物(10 μM)各0.5 μL，雙蒸水8 μL，2×PCR擴(kuò)增緩沖液(0.05 u/μL Taq polymerase，4 mM MgCl2，0.4 mM dNTPs 10 μL).PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃ 加熱3 min；然后共進(jìn)行34個溫度循環(huán)：94 ℃ 變性30 s，50 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s；最后在72 ℃ 延伸5 min.PCR產(chǎn)物各取5 μL與5 μL的100 bp DNA ladder用2.0%的瓊脂糖凝膠(agarose gel)在80 V電壓下電泳15 min，再用0.5 g/mL的溴乙錠(EB, ehidium bromide)染色10 min后在波長365和254 nm的紫外線下觀察.顯示單一、明亮擴(kuò)增區(qū)段長度條帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(CaM約700 bp，ITS約600 bp)由生物技術(shù)有限公司用ABI3730 (Applied Biosystems，Drive Foster City，CA，USA)進(jìn)行雙向直通測序.

1.4 分子種系學(xué)分析

原始序列用生物學(xué)軟件Bioedit 7.0.9[21]進(jìn)行人工校對、編輯，得到準(zhǔn)確無誤的全區(qū)段序列，提交到GenBank(AS3.15811:CaM=MN857548，ITS=MN847718；AS3.15848:CaM=MN857549，ITS=MN847719).島籃狀菌組物種的模式菌株和本研究的兩個菌株的CaM和ITS序列分別用MEGA 6[22]進(jìn)行對位排列后(alignment)剔除序列不完整的菌株，做成序列矩陣(CaM共有34株，ITS共有31株).然后用最大可能法(Maximum Likelihood，ML)分析，并采用自展法(bootstrap)進(jìn)行1000次重復(fù)評估各分支的可靠性，其中空格(gaps)選擇partial deletion[23].

2 結(jié)果

通過形態(tài)學(xué)和基于CaM與ITS的分子種系學(xué)分析，確定在青海省西寧市湟中縣塔爾寺和河南省洛陽龍門石窟土壤分離到的這兩株籃狀菌分別為安拉阿巴德籃狀菌(T.allahabadensis, AS 3.15811=12260)和鴿色籃狀菌(T.columbinus, AS3.15848=14002)，均為我國新記錄種(圖1-圖4).

2.1 安拉阿巴德籃狀菌

Talaromyces allahabadensis(B.S.MEhrobtra & D.Kumar) Samson，N.Yilmaz & Frisvad，Stud.Mycol.70: 174.2011(圖1)

在查氏酵母精瓊脂(CYA)上25 ℃，7 d，菌落直徑24-25 mm，較厚，中央稍凹陷，少量輻射狀溝紋；邊緣完整；質(zhì)地絨狀；分生孢子結(jié)構(gòu)稀疏；菌絲呈鋇黃色(Baryta Yellow) (R.Pl.IV)；滲出液無；可溶性色素?zé)o；反面橙紅色.

在麥芽精瓊脂(MEA)上25 ℃，7 d，菌落直徑16-18 mm，較厚，凸面，平坦，邊緣完整；質(zhì)地絨狀；分生孢子結(jié)構(gòu)稀疏，灰綠色；菌絲淺綠黃色，近于淺鮮綠色Light Viridine Green(R.Pl.VI)；滲出液無；可溶性色素?zé)o；反面棕紅色.

在查氏酵母精瓊脂(CYA)上37 ℃，7 d，菌落直徑20-22 mm，菌落特征類似CYA上25 ℃.

分生孢子梗產(chǎn)生于表面菌絲，孢梗莖(60-)90-150(-200) μm× 2-2.5 μm，頂端不膨大，壁光滑；帚狀枝雙輪生；?；?-6個每輪，排列不緊密，10-11 μm× 2-2.5 μm；瓶梗安瓿形，排列不緊密，每輪2-6個，10-11 μm× 2-2.5 μm，梗頸較粗較長；分生孢子檸檬形，3-3.5 μm× 2-2.5 μm，壁光滑.

主要特征：生長緩慢，產(chǎn)生絨狀菌落，分生孢子稀疏，灰綠色，帚狀枝雙輪生，排列不緊密，菌絲橙黃色，瓶梗安瓿形，分生孢子檸檬形，壁光滑.

分布和基物：青海省西寧市湟中縣塔爾寺土壤(AS 3.15811=12260).

2.1 鴿色籃狀菌

Talaromyces columbinusS.W.Peterson & Jurjevi?,PLoS ONE 8(10): e78084，2013( 圖2)

在查氏酵母精瓊脂(CYA)上25 ℃，7 d，菌落直徑8-10 mm，較厚，突起，表面具少量輻射狀溝紋，邊緣于培養(yǎng)基內(nèi)，波曲狀；質(zhì)地絨狀；分生孢子結(jié)構(gòu)大量，深藍(lán)灰色；菌絲體淡橙黃色，邊緣白色；滲出液無；可溶性色素?zé)o；反面棕黃色.

在麥芽精瓊脂(MEA)上25 ℃，7 d，菌落直徑10 -12 mm，較薄，中央突起，輻射狀溝紋少量，邊緣于培養(yǎng)基表面，完整；質(zhì)地絨狀；分生孢子結(jié)構(gòu)大量，暗藍(lán)綠色或灰綠色；菌絲體黃白色；滲出液無；可溶性色素?zé)o；反面褐黃色.

在查氏酵母精瓊脂(CYA)上37 ℃，7 d，菌落直徑25 mm，菌落特征類似CYA上25 ℃.

分生孢子梗產(chǎn)生于氣生菌絲，孢梗莖10-60 μm × 3-5 μm，頂端膨大約6 μm，壁光滑；帚狀枝雙輪生；梗基8-12個每輪，排列緊密，7-10 μm × 3-4 μm，頂端膨大約5 μm；瓶梗披針形或圓柱形，排列緊密，每輪4-6個，7-9 μm× 2.5-3 μm，梗頸較長；分生孢子變化較大，球形至橢球形，3-5 μm× 3-4 μm，壁光滑.

主要特征：生長較慢，產(chǎn)生致密絨狀菌落，分生孢子藍(lán)灰色，帚狀枝典型雙輪生，排列緊密，孢梗莖和?；敹伺虼?，球形至橢球形或梨形，壁光滑.

分布和基物：河南省洛陽龍門石窟荒野土壤(AS 3.15848=14002).

3 討論

從菌落形態(tài)學(xué)看，發(fā)現(xiàn)于我國的T.allahabadensis菌株AS 3.15811與模式菌株CBS 453.93生長速率非常相近，雖然它們的產(chǎn)孢能力差別較大，AS 3.15811在CYA和MEA上產(chǎn)生稀疏分生孢子，而CBS 453.93則產(chǎn)生大量深灰綠色分生孢子，但其顯微結(jié)構(gòu)完全相同.另外，它們的CaM序列一個堿基也不差，ITS序列只相差1個堿基，而且基于CaM和ITS分子系統(tǒng)學(xué)分析顯示這兩株菌以100%的支持率聚在一起.我國的T.columbinus菌株AS 3.15848比模式菌株NRRL 5881生長稍慢，在CYA和MEA上產(chǎn)分生孢子比NRRL 5881更多[24-26].但其CaM和ITS序列以及顯微形態(tài)完全相同，而且CaM和ITS分子系統(tǒng)發(fā)育樹也顯示這兩株菌以100%的支持率聚在一起(圖3, 4).因此，可以確認(rèn)我國的這2株菌鑒定無誤.

本研究報道的Talaromycessect.Islandici這兩個我國新紀(jì)錄種在我國尚屬罕見，在作者長達(dá)20多年的青霉與曲霉的物種調(diào)查及分類工作中屬于首次發(fā)現(xiàn)，而且只發(fā)現(xiàn)于青海(T.allahabadensis)和河南(T.columbinus)兩省。但根據(jù)國際報道，這兩個種分布范圍應(yīng)該較廣泛，如T.allahabadensis發(fā)現(xiàn)于印度、泰國、墨西哥及歐洲等地，T.columbinus則發(fā)現(xiàn)于美國和肯尼亞[27].可能是該兩種生長緩慢，在分離培養(yǎng)過程尚未長出就被快速生長的種類覆蓋.在本研究中我們對Malloch的分離方法做了改進(jìn)，采用0.1%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)代替水作溶劑制作土壤懸濁液，土壤微?？梢詰腋∮谌軇┎灰壮恋?，因而分散效果較好，這樣涂平板后樣品散布均勻.而且從培養(yǎng)第3天開始觀察并挑取單菌落，此時生長緩慢的物種已長出微小菌落而尚未被生長快速的物種覆蓋便被挑出.采用本改進(jìn)的分離方法可以成功分離到土壤稀有物種或生長緩慢的物種.