呂聰聰 張 柳 侯 越 劉 偉

(陜西師范大學 化學化工學院、陜西省生命分析化學重點實驗室，陜西 西安 710119)

0 引言

三聚氰胺(C3H6N6)中的含氮量非常高(通常按照質(zhì)量計為66.6%)，且有成本低的[1]特性.近年來，三聚氰胺被非法添加在嬰幼兒配方奶粉、牛奶和寵物食品中，在檢測時，其蛋白質(zhì)的含量可以高于我們用凱氏定氮法測定的蛋白質(zhì)含量，使消費者被誤導(dǎo).而這些產(chǎn)品在奶制品市場上獲得廉價的價格.但三聚氰胺在和它的水解產(chǎn)物三聚氰酸結(jié)合后，卻造成腎小管中不溶性結(jié)晶生成，這可能會使腎功能衰竭[2].因此，奶制品和其它食品中三聚氰胺的量需要嚴格控制.我國政府規(guī)定，三聚氰胺在嬰幼兒食品和其它食品中的最大允許殘留量分別為1.0 mg/kg和2.5 mg/kg[3].目前測定三聚氰胺含量的主要方法有色譜法[4]、毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用法[5]、電化學法[6]、表面增強拉曼散射光譜法[7,8]、熒光光譜法[9,10]，比色法[11]等.

而在這些檢測方法中，目視比色法具有簡單、快速、可適合現(xiàn)場檢測及易普及的特點而引起人們的廣泛關(guān)注.在納米金比色法中，2011年前后，酶聯(lián)免疫分析和膠體金免疫層析試紙[12]是主要的檢測方法.通過合成未修飾或修飾過的Au納米粒子，利用其與三聚氰胺發(fā)生團聚顯色而發(fā)展了一系列的納米金測定三聚氰胺含量的目視比色法[13,14].在近三年的研究中，利用其他方法修飾或適配體功能化的納米金及未修飾的納米銀[15-18]，也達到對三聚氰胺檢測的目的.但膠體金免疫層析試紙會涉及到噴金等操作，實驗成本比較高，將納米粒子滴涂在紙上會使其團聚，因此發(fā)展納米粒子測定的紙芯片具有一定的難度.在利用3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)-H2O2顯色體系[22-26]來檢測三聚氰胺的相關(guān)工作中，一般實驗孵育時間比較長，且需要加熱等操作，因此發(fā)展孵育時間短的TMB顯色體系有一定的優(yōu)勢.近年來，紙芯片[19-21]以其具有成本低、易操作、可攜帶等優(yōu)點而受到關(guān)注.本文旨在建立一種紙上測定三聚氰胺的快速測定方法，以辣根過氧化物酶(HRP)- TMB- H2O2顯色體系[27-29]為基礎(chǔ)，利用三聚氰胺可以使該顯色體系的顯色增強的現(xiàn)象，建立了一種比色法測定三聚氰胺的紙芯片.該顯色方法不需加熱等操作，室溫孵育5 min即可測定，反應(yīng)所需的試劑量很少，且具有即用即拋、不會產(chǎn)生樣品交叉污染的特點.該方法測定三聚氰胺的檢出限為5 μM，可實現(xiàn)牛奶樣品中的三聚氰胺含量的快速測定.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：富士施樂蠟打印機(8570，富士施樂有限公司，美國)；佳能數(shù)碼相機(Canon EOS 550D，日本)；TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計(UV-1800，日本島津儀器有限公司).

試劑及材料：Whatman 1號濾紙(200.0 mm×200.0 mm，Sigma)；辣根過氧化物酶(HRP)(上海雪滿生物科技有限公司)(純度：R.Z>3.1%)；3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(北京索萊寶科技有限公司)(純度：>98%)；過氧化氫(國藥集團化學試劑有限公司)；無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)(純度：AR)；牛奶樣品購于本地超市，試劑用水均為超純水(18.2 MΩ·cm).

1.2 紙芯片的制作

采用文獻報道過的蠟打印法制作紙芯片[21,30,31]，首先用CorelDRAW X5畫圖軟件設(shè)計直徑為6 mm的紙芯片微區(qū)域，將設(shè)計的紙芯片按DXF格式保存后用切割控制軟件(ROBO Master-Pro)打開后，將紙張放在模型版上，用切割機(Graphtec Craft Robo-S)切出所要的圖形，將設(shè)計好的圖案用蠟打印機打印，將打印好的紙芯片放在烘箱中，在150 ℃下加熱150 s，蠟圈在高溫下會融化并且滲透到紙纖維的內(nèi)部，這樣就會在紙芯片上形成疏水區(qū)域.

1.3 儲備液的制備

20.0 mM 的TMB的制備：準確稱取0.0480 g粉末狀的TMB，用無水乙醇定容至10 mL，渦旋振蕩 1 min，超聲15 min.避光保存，備用.

1.0 mM三聚氰胺標準溶液的制備: 準確稱取0.0126 g的三聚氰胺，用超純水溶解后轉(zhuǎn)移定容至100 mL.使用時逐級稀釋.

1.4 三聚氰胺的檢測

將1.6 μL的濃度為1.2 μM的HRP，3.0 μL 濃度為7.0 mM的TMB及2 μL的濃度為 0.7 mM的H2O2按順序滴加到直徑為6 mm的紙芯片上，室溫反應(yīng)5 min.作為對照組.按上述同樣的方法，最后再將1.0 μL不同濃度的三聚氰胺標準溶液滴加到紙芯片上，室溫反應(yīng)5 min.以三聚氰胺的濃度為橫坐標，以相對強度 (加入三聚氰胺前后，所測灰度的變化) 為縱坐標，繪制工作曲線.

1.5 市售牛奶樣品處理

參照文獻[32]的方法對市售牛奶處理.分別取5.0 mL牛奶(牛奶樣品1，牛奶樣品2，牛奶樣品3)，加入 1.5 mL 2.0 M的三氯乙酸，渦旋振蕩1min，超聲處理10 min后，混合物以 13000 r/min 離心 10 min.取上清液過濾，用1 mol/L Na2CO3調(diào)至pH 8.0，再以 3000 r/min 離心3 min，取上清液，待用.

2 結(jié)果與討論

2.1 比色法檢測三聚氰胺的原理

實驗中考查了HRP-TMB-H2O2及三聚氰胺加入該體系中的紫外可見吸收曲線，如圖1所示，HRP-TMB-H2O2溶液呈淺藍色(插圖a)，吸收光譜為圖1 中黑線，652 nm可產(chǎn)生特征吸收峰.向HRP-TMB-H2O2溶液中加入三聚氰后，溶液的顏色加深，變?yōu)檩^深的藍色(插圖 b)，652 nm處的吸收強度增加，且吸收位置不變 ( 圖1，紅線)，并未出現(xiàn)新的吸收帶.HRP催化H2O2氧化TMB成為ox-TMB而顯藍色，在HRP-TMB-H2O2體系中添加三聚氰胺前后，吸收強度有所增加，是因為三聚氰胺可以提高過氧化物酶的催化速度[33]，在同樣時間內(nèi)，反應(yīng)速度加快，在立即添加三聚氰胺后，使同一時間點顏色加深，表明反應(yīng)中三聚氰胺可以增強HRP-TMB-H2O2的顯色反應(yīng)，起到催化的作用，并沒有新的物質(zhì)產(chǎn)生.

2.2 反應(yīng)時間對體系的影響

對于TMB顯色體系，顯色時間長短會影響測定結(jié)果，因此首先考察顯色時間的影響.在TMB、H2O2和HRP的濃度為7.0 mM、0.7 mM和1.2 μM時，在室溫條件下，用一定濃度的三聚氰胺，測定了1-11 min內(nèi)顯色反應(yīng)的相對強度變化值，結(jié)果如圖2(a)所示，當顯色時間達到5 min 時，反應(yīng)具有最佳的顯色效果.因此，選擇顯色反應(yīng)時間為5 min.

2.3 pH對體系的影響

已有研究表明，pH對實驗顯色反應(yīng)的效果起著重要作用[11]，當pH值低于3時，會影響到TMB-H2O2的性質(zhì)，反應(yīng)受到抑制.然而，如果pH過高，HRP會失活.因此在pH為3.0-7.0的范圍內(nèi)考察了pH對該顯色反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖2(b)所示.實驗結(jié)果表明該體系在pH為4.5時體系有最佳的顯色效果.

2.4 HRP、TMB、H2O2濃度對體系的影響

為了在最佳的顯色體系下檢測三聚氰胺，HRP、TMB、H2O2的濃度也需要優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果如圖2(c)-(e)所示.在pH為4.5，反應(yīng)時間為5 min，TMB濃度為7.0 mM、H2O2濃度為0.7 mM的條件下，在0.1-1.5 μM濃度范圍內(nèi)考察了HRP對顯色體系的影響.隨著HRP的濃度0.2-1.2 μM不斷增大，所測的相對強度逐漸增大，當濃度大于1.2 μM時，相對強度逐漸減小，所以在以后的實驗中，選擇1.2 μM的HRP，結(jié)果如圖2(c)所示.

在pH為4.5，反應(yīng)時間為5 min，HRP濃度為1.2 μM、H2O2濃度為0.7 mM的條件下，在1-10 mM濃度范圍內(nèi)考察了TMB對顯色體系的影響.隨著TMB的濃度從1.0 mM到7.0 mM不斷增大，所測的相對強度逐漸增大，當濃度大于7.0 mM時，相對強度逐漸減小，所以在以后的實驗中，選擇7.0 mM的TMB，結(jié)果如圖2(d)所示.

在pH為4.5，反應(yīng)時間為5 min，HRP濃度為1.2 μM、TMB濃度為7.0 mM的條件下，在0.1-1.0 mM濃度范圍內(nèi)考察了H2O2對顯色體系的影響.隨著H2O2的濃度從0.1 mM到0.7 mM不斷增大，所測的相對強度逐漸增大，當濃度大于0.7 mM時，過氧化氫的分解對實驗結(jié)果有影響，會使測定的相對強度逐漸減小，所以在以后的實驗中，選擇0.7 mM的H2O2，結(jié)果如圖2(e)所示.

2.5 干擾實驗

為了將本方法用于實際樣品的檢測，考察了牛奶中可能出現(xiàn)的物質(zhì)[11]對三聚氰胺測定的影響.在上述所選的最佳實驗條件下進行，即HRP的濃度為1.2 μM，TMB的濃度為7.0 mM，H2O2的濃度為0.7 mM，pH值為4.5這一條件下，進行干擾實驗的測定.

在對照組和實驗組中三聚氰胺的含量相等，進行干擾測定的實驗組中逐一添加各干擾物，當干擾物質(zhì)的濃度為三聚氰胺濃度的20倍時(實驗中三聚氰胺的濃度為100 μM，其它物質(zhì)濃度均為2 mM)，測其相應(yīng)強度，再與對照組中只有三聚氰胺的響應(yīng)信號進行對比，發(fā)現(xiàn)響應(yīng)基本相當，說明該反應(yīng)體系對三聚氰胺測定時，其他物質(zhì)并不會明顯的增加或者減弱響應(yīng)信號，所以結(jié)果表明，20倍的Zn2+、K+、Ca2+、乳糖、葡萄糖、半胱氨酸、賴氨酸、甘氨酸、維生素C和胸腺嘧啶均不會影響牛奶中三聚氰胺的測定.

1.6 三聚氰胺標準曲線的繪制及線性分析

在所選擇的最佳實驗條件下，本研究利用比色法，通過觀察紙芯片顏色的變化與三聚氰胺的濃度存在一定的線性關(guān)系，將紙芯片的顏色利用Image-J軟件處理轉(zhuǎn)化成灰度，在添加三聚氰胺前后灰度的差值即為相對強度.實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對強度值與三聚氰胺的濃度在10 μM-1.0 mM呈現(xiàn)線性關(guān)系.為了獲得更好的線性關(guān)系，我們采用分段線性的方法.針對10 μM -100 μM 和100 μM-1.0 mM兩個不同的線性范圍，線性回歸方程分別為y=15.7x+19.7 (R2=0.9933)和y=4.7x+26.3 (R2=0.9843) (其x單位為10-4M) 如圖4所示.隨著三聚氰胺濃度的增大，其相對強度也逐漸增強.對不同濃度梯度的三聚氰胺進行了5次平行測定，相對標準偏差為3.1 %.

表1 三聚氰胺檢測各比色方法的對比

該方法的檢出限為5 μM，且選取幾種不同的比色方法從檢出限，線性，反應(yīng)條件，所用方法這幾個方面進行對比，該研究所需時間短，不需加熱，并列表對其檢出限進行對比，如表1所示.

2.7 樣品加標回收測定

為了評價本實驗方法的可靠性和實用性[34-36]，我們將本方法用于測定牛奶中三聚氰胺的含量.將一定量的三聚氰胺標準溶液加入到樣品溶液中，實驗數(shù)據(jù)如表2所示，觀察樣品溶液中加入三聚氰胺標準品前后的回收率變化，結(jié)果表明該方法可靠且本方法可以用于實際牛奶樣品的檢測.

表2 三聚氰胺加標回收樣品測定結(jié)果

3 結(jié)論

本研究在紙芯片上利用HRP-TMB-H2O2顯色體系成功實現(xiàn)了牛奶中的三聚氰胺含量的檢測，未加入三聚氰胺時，紙芯片呈現(xiàn)淺藍色，加入三聚氰胺后，顯色反應(yīng)增強，基于上述現(xiàn)象，以紙芯片為反應(yīng)載體，通過比色法可以建立快速測定三聚氰胺的比色分析方法.該方法測定三聚氰胺的檢出限為5 μM.由于紙芯片具有反應(yīng)所需的試劑量很少、即用即拋及樣品不會交叉污染的特點，因此該方法開辟了一種簡單快速、低成本的紙上檢測三聚氰胺新途徑.