萬燁東 陳澤維 王楓 陳孝貞 盧俊青 毛紅嬌 侯瑋瑋 張云

1 紹興文理學院醫(yī)學院（浙江紹興312000）

2 浙江大學醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院（浙江杭州310000 ）

人工關節(jié)置換術是用人工材料制成的假體關節(jié)置換和代替損傷或病損關節(jié)，能有效減輕患者關節(jié)疼痛、重建關節(jié)功能，提高患者生活質(zhì)量，是目前治療晚期嚴重骨關節(jié)疾病的最重要手段。然而，隨著關節(jié)置換病例的增加和時間的延長，假體晚期松動問題日益突出。大量研究表明，聚乙烯（polyethylene，PE）、鈦（titanium，Ti）和磷酸三鈣（tricalcium phosphate，TCP）等三類關節(jié)假體植入體內(nèi)后，經(jīng)過長期磨損、碰撞產(chǎn)生大量的磨損顆粒，這些微米粒徑的細小顆粒聚集于假體表面會刺激假體周圍組織細胞釋放腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、白介素1β（interleukin-1 beta，IL-1β）和白介素6（interleukin-6，IL-6），誘導假體周圍破骨細胞生成和炎癥性骨溶解[1-3]。目前治療假體周圍骨溶解主要有雙膦酸鹽和抗炎藥物，這些藥物雖然有一定的治療效果，但均存在諸多副作用，不宜長期服用。因此，尋找一種高效、毒副作用少，能長期應用于治療假體周圍骨溶解及關節(jié)松動的藥物已迫在眉睫。

佛手苷內(nèi)酯（bergapten，BP）為一種天然的香豆素類化合物，廣泛存在于佛手、新鮮芹菜、檸檬、歐芹和歐防風等食品中，具有抗炎、降血酯和抗腫瘤等活性[4，5]。以往研究與我們前期實驗結果顯示佛手苷內(nèi)酯可抑制核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κ B ligand，RANKL）和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）介導的破骨細胞生成、存活及骨吸收[6，7]。而關于佛手苷內(nèi)酯對TCP 磨損顆粒誘導的假體周圍炎癥性骨溶解的影響如何，目前尚不清楚。本研究應用前期成功構建的TCP磨損顆粒誘導小鼠顱骨溶解模型，研究佛手苷內(nèi)酯對假體周圍骨溶解、破骨細胞生成、炎癥因子釋放、炎癥小體活化及細胞焦亡的影響，探討佛手苷內(nèi)酯對TCP 磨損顆粒誘導的假體周圍骨溶解的保護作用及分子機理，為研究防治假體周圍骨溶解及關節(jié)松動提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性6～8 周齡ICR 小鼠，體重18～22 g，清潔級，購自浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（浙）2014-0001，合格證號1603090018。

1.2 小鼠顱骨溶解模型的構建[3]與實驗分組

SPF級雄性6～8周齡ICR小鼠60只隨機分為假手術組（Sham組）、TCP磨損顆粒組（TCP組）、佛手苷內(nèi)酯5 mg/kg 組（BP 5 mg/kg 組）、佛手苷內(nèi)酯10 mg/kg 組（BP 10 mg/kg 組）和佛手苷內(nèi)酯20 mg/kg 組（BP 20 mg/kg 組），每組12只。各組小鼠稱量體重后分別經(jīng)腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉（60 mg/kg）麻醉后，無菌條件下取顱頂正中矢狀切口，長約0.8 cm，分離皮下組織，露出面積為1 cm×1 cm 方形顱骨區(qū)域。其中Sham 組進行原位縫合，其余四組取TCP磨損顆粒（30 mg）置于顱頂處后縫合皮膚。假手術和佛手苷內(nèi)酯組小鼠于術后第2 天于顱頂部位分別注射生理鹽水和佛手苷內(nèi)酯，隔日注射1 次，持續(xù)2 周。實驗結束后，各組小鼠稱量體重后通過摘除眼球取血；同時取出顱骨（以正中矢狀縫為中心的方形區(qū)域），磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、濾紙吸去多余水分后分析天平稱量顱骨濕重（mg）。

1.3 測試指標與方法

1.3.1 TRAP染色觀察假體周圍骨溶解

各組小鼠的顱骨經(jīng)4%多聚甲醛固定10 min、超聲清洗5 min 后，置于系列梯度乙醇（50%、80%、90%和100%）中脫水，自然晾干后放入TRAP染色液中室溫避光染色60 min。PBS 清洗2 次后，置于IX70 顯微鏡下觀察顱骨表面侵蝕程度，并利用Image Pro Plus 6.0圖像處理軟件分析正中矢狀線區(qū)域骨溶解面積。

1.3.2 HE染色觀察假體周圍破骨細胞生成

各組顱骨經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h 和10% EDTA（pH 7.4）脫鈣2周后進行石蠟包埋，后經(jīng)切片機對顱骨矢狀面連續(xù)切片（厚度為7 μm），脫蠟后行HE 染色。每只小鼠顱骨隨機選取5張切片置于IX70顯微鏡下觀察3 個視野中破骨細胞生成情況變化。利用Image Pro-Plus 6.0（美國Media Cybernetics公司）軟件計算正中矢狀縫區(qū)域三個核及以上破骨細胞數(shù)目。

1.3.3 ELISA法檢測

實驗結束后，各組小鼠分別于眼眶后靜脈叢采血1.0 ml 置于EP 管中，待血液凝固后于（4 °C，3000 r/min）離心10 min，取上清液即為血清。

取96孔培養(yǎng)板，每孔加入20 μl血清，分別按照說明書檢測小鼠血清中TNF-α、IL-1β、白介素18（interleukin-18，IL-18）和RANKL水平。

1.3.4 Western blot檢測蛋白表達[8]

各組假體周圍骨組織加入RIPA 裂解液置于冰上裂解30 min。經(jīng)12000 r/min 離心15 min 收集上清液，應用BCA?試劑盒檢測各組總蛋白濃度。每孔加入等量蛋白樣品行12%SDS-PAGE 分離，電泳完成后將蛋白轉移到PVDF 膜上，經(jīng)5%脫酯奶粉常溫封閉2 h后，分別加入兔抗NLRP3（1∶1000 稀釋）、兔抗ASC（1∶1000 稀釋）、兔抗IL-1β （1 ∶1000 稀釋）、兔抗cleaved caspase-1（1：1000 稀釋）和小鼠抗β-actin（1∶1000 稀釋）等單克隆抗體于4 °C 孵育過夜。次日經(jīng)TBST 洗滌3 次后加入HRP 標記的二抗室溫孵育2 h，TBST 清洗3 次加入ECL 顯色液；通過凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各蛋白表達的變化。

1.4 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計處理用GraphPad Prism 5.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（±s）表示。各組采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，并利用紐曼-科伊爾斯（Newman-Keuls）檢驗進行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠體重和顱骨濕重變化

表1顯示，從實驗開始至結束，Sham 組、TCP 組和BP 各劑量組小鼠體重均相似，無顯著性差異，表明BP對小鼠體重基本無影響。而各組小鼠的顱骨濕重差異明顯，表現(xiàn)為：與Sham組比較，TCP 組顱骨濕重明顯減少（P＜0.05）；與TCP組比較，BP組小鼠顱骨濕重顯著增加（P＜0.05），并呈一定的劑量依賴性（P＜0.05）。

表1 各組小鼠體重和顱骨濕重比較（n=12）

2.2 各組小鼠顱骨假體周圍骨溶解程度比較

與Sham 組比較，TCP 組小鼠顱骨假體周圍（正中矢狀縫）發(fā)生明顯骨溶解，骨溶解面積顯著增加（P＜0.05）；與TCP 組比較，BP 組小鼠顱骨表面骨溶解程度顯著減輕，其中BP 20 mg/kg 組的骨溶解面積減少更為明顯，僅為TCP 組小鼠骨溶解面積的37.13%（P＜0.05）。見圖1。

2.3 各組小鼠顱骨假體周圍破骨細胞生成比較

與Sham 組比較，TCP 組小鼠假體周圍破骨細胞生成顯著增多（圖2，P＜0.05），血清中TRAP 和capthesin K 活性及RANKL 含量明顯增加（表2，P＜0.05）；與TCP組比較，BP 組假體周圍破骨細胞生成明顯減少（圖2，P＜0.05），血清中TRAP、capthesin K 活性和RANKL 水平顯著減少（表2，P＜0.05）。

圖1 TRAP染色觀察小鼠假體周圍骨溶解情況（n=6）

圖2 HE 染色觀察小鼠假體周圍破骨細胞生成（n=6）

表2 各組小鼠血清中破骨細胞生成相關蛋白活性或含量的變化（n=12）

2.4 各組小鼠血清中炎癥因子釋放情況

與Sham組比較，TCP 組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-18水平明顯增加，分別為Sham組的1.79倍、3.54倍和2.78 倍（表3，P＜0.05）；與TCP 組比較，BP 組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-18 水平明顯減少（P＜0.05，表3）。

表3 ELISA法檢測各組小鼠血清中炎癥因子的水平（n=12）

2.5 各組小鼠假體周圍骨組織炎癥小體活化及細胞焦亡的比較

上述實驗結果顯示低劑量組（5 mg/kg）對TCP 磨損顆粒所致小鼠顱骨溶解及相關指標的影響不明顯，且與TCP比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），故在此僅設10 mg/kg 和20 mg/kg 兩個劑量組研究BP 對炎癥小體活化及細胞焦亡的影響。Western blot結果顯示：與Sham 組比較，TCP 組小鼠假體周圍骨組織中NLRP3、ASC、cleaved caspase-1和IL-1β表達均明顯上調(diào)，血清中IL-1β、IL-18 水平和LDH 釋放顯著增加（圖3，P＜0.05）。與TCP 組比較，BP 組骨組織中NLRP3、ASC、cleaved caspase-1和IL-1β表達及血清中IL-1β、IL-18水平和LDH釋放明顯減少（表3、圖3，P＜0.05）。

圖3 Western blot法檢測小鼠假體周圍骨組織炎癥小體的活化（n=6）

3 討論

人工關節(jié)置換術是治療終末期關節(jié)疾患、重建關節(jié)功能的重要手段。大量研究表明，人工關節(jié)假體經(jīng)過長期磨損、碰撞會產(chǎn)生大量的磨損顆粒包埋于假體周圍組織中，這些顆粒可誘導假體周圍組織細胞釋放多種炎癥因子，促進假體周圍破骨細胞分化、骨溶解和關節(jié)晚期松動，最終導致關節(jié)置換失敗及關節(jié)二次翻修[1-3]。本研究首先應用TRAP 染色證實了TCP 磨損顆粒可誘導小鼠顱骨中縫發(fā)生明顯的骨溶解，成功模擬了關節(jié)假體周圍磨損顆粒誘導的骨溶解病理過程，與以往報道結果基本一致。這表明該模型可用于磨損顆粒誘導假體周圍骨溶解的干預治療。

佛手苷內(nèi)酯是從天然食品佛手、新鮮芹菜、檸檬、歐芹和歐防風等中分離出來的一種香豆素類的化合物，具有抗炎、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等藥理學作用。Ham等[9]報道佛手苷內(nèi)酯（折算后劑量約為20 mg/kg）喂養(yǎng)能增加小鼠股骨和脛骨的骨密度（bone mineral density，BMD）和骨體積分數(shù)（bone volume density，BV/TV），抑制破骨細胞的分化及形成，減少高脂飲食或四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。最近Chen[10]等研究認為腹腔注射佛手苷內(nèi)酯（10 mg/kg、20 mg/kg）可顯著抑制卵巢切除引起的骨質(zhì)疏松小鼠脛骨的骨小梁結構的變化而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松癥作用。本研究結果顯示佛手苷內(nèi)酯（5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg）明顯阻止假體周圍破骨細胞生成及骨溶解，并呈一定的劑量依賴性。其中佛手苷內(nèi)酯（20 mg/kg）對破骨細胞生成和骨溶解的抑制作用與Ham 等和Chen 等所報道的同劑量佛手苷內(nèi)酯對卵巢切除或糖尿病所造成的骨質(zhì)疏松癥小鼠骨溶解的影響相似[9，10]。

有證據(jù)表明破骨細胞膜上高表達的核因子受體κB激活蛋白（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）和RANKL可誘導破骨細胞的分化[11]，同時分泌TRAP、cathepsin K 和基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）等蛋白酶降解或溶解骨基質(zhì)[12]，最終形成骨吸收窩陷。因此，RANKL水平及破骨細胞特征蛋白TRAP和cathepsin K 活性的改變常用來反映破骨細胞分化程度及功能狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)TCP磨損顆粒可明顯增加血清中RANKL 水平，并顯著上調(diào)TRAP 和capthesin K 的活性，促進破骨細胞的生成及骨溶解。而佛手苷內(nèi)酯干預可劑量依賴性地抑制TCP磨損顆粒誘導的RANKL水平的上調(diào)及TRAP和cathepsin K活性的增加，阻止假體周圍骨溶解和破骨細胞的生成。

以往研究和我們前期實驗結果顯示TCP磨損顆?？纱碳ぜ袤w周圍巨噬細胞、成纖維細胞、成骨細胞和骨細胞釋放TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18等多種因子，這些破骨細胞活化因子可誘導破骨細胞活化并促進骨吸收，提示炎癥因子在TCP 磨損顆粒誘導的假體周圍骨溶解中發(fā)揮重要作用，可作為假體周圍骨溶解和關節(jié)晚期松動的治療靶點。本研究通過ELISA 法檢測到TCP 磨損顆?？烧T導炎癥因子的釋放，增加血清中TNF-α、IL-1β和IL-18的含量；而佛手苷內(nèi)酯干預可顯著抑制上述炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應[4，13，14]及假體周圍炎癥性骨溶解。結合以往研究數(shù)據(jù)及本實驗研究結果表明，佛手苷內(nèi)酯具有較好的抗炎作用，它可通過減少炎癥因子的釋放而實現(xiàn)對TCP磨損顆粒誘導假體周圍炎癥性骨溶解的保護作用，但是其調(diào)控機制尚不明確。

炎癥小體及細胞焦亡的激活可引起強烈的炎癥小體反應，并誘導破骨細胞的分化、存活和骨吸收[15-17]，表明炎癥小體能調(diào)控炎癥性骨吸收疾病。炎癥小體是存在于細胞質(zhì)中的一種蛋白復合物，由NLRP3、ASC 和caspase-1等3部分構成。NLRP3炎癥小體被激活后通過接頭蛋白ASC，募集半胱天冬氨酸蛋白酶1前體，進而自我催化加工形成切割型caspase-1；活化的caspase-1 能切割IL-1β和IL-18 前體使其形成成熟的IL-1β和IL-18 并分泌至胞外，促進細胞焦亡[18，19]。而抑制NLRP3 炎癥小體的活化及細胞焦亡，將緩解上述NLRP3 的異?；罨跋嚓P炎癥性疾病的癥狀[20]。Caiced等[21]證實敲除NALP3或ASC基因可阻止Co-Cr-Mo顆粒誘導的巨噬細胞THP1釋放IL-1β；Pierre[22]則認為Ti 顆粒誘導巨噬細胞釋放IL-1β與NALP3、ASC 和caspase-1的高表達密切相關。同樣PMMA顆粒介導的炎癥性骨溶解也與NLRP3的活化有關[23]。本研究結果顯示TCP磨損顆粒可誘導NLRP3炎癥小體的活化和細胞焦亡，表現(xiàn)為：與Sham組比較，TCP 組小鼠假體周圍骨組織中NLRP3、ASC、cleaved caspase-1 和IL-1β表達均明顯上調(diào)，血清中IL-1β、IL-18 水平和LDH 釋放顯著增加。綜上，我們推測炎癥小體參與調(diào)控磨損顆粒介導的炎癥反應及破骨細胞生成和骨溶解。

佛手苷內(nèi)酯干預可顯著減弱TCP磨損顆粒誘導假體周圍骨組織中NLRP3 炎癥小體的活化與細胞焦亡，從而抑制caspase-1 的活化和成熟IL-1β和IL-18 等炎癥因子及LDH 的釋放，其趨勢與佛手苷內(nèi)酯對破骨細胞生成和骨溶解面積等指標的影響基本一致，這表明佛手苷內(nèi)酯可通過減輕NLRP3 炎癥小體的活化，抑制炎癥因子的釋放而阻止TCP磨損顆粒誘導的假體周圍炎癥性骨溶解。但是，關于佛手苷內(nèi)酯是否影響炎癥小體NLRP3活化之后的下游產(chǎn)物水平以及佛手苷內(nèi)酯是通過何種信號轉導途徑抑制炎癥小體NLRP3表達等問題還有待于后續(xù)進一步深入研究。

4 結論

佛手苷內(nèi)酯可通過減弱炎癥小體的活化和細胞焦亡，抑制炎癥小體的釋放而阻止TCP 磨損顆粒誘導的假體周圍骨溶解及關節(jié)松動。