陳靜 董家新 趙豐麗

摘要 [目的]采用超聲輔助提取泡桐葉中熊果酸，為泡桐熊果酸的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。[方法]通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、料液比、超聲波功率和提取次數(shù)對熊果酸得率的影響。[結(jié)果]經(jīng)方差分析和驗(yàn)證試驗(yàn)確定了從泡桐葉中提取熊果酸的最佳提取條件為乙醇濃度90%、料液比1∶20（g∶mL）、提取時(shí)間40 min、提取溫度65 ℃、提取次數(shù)3次、超聲波功率350 W，在該提取工藝條件下熊果酸得率為0.742%。[結(jié)論]超聲法提取是一種效率高、條件溫和且操作簡單的大眾化的提取熊果酸的方法。

關(guān)鍵詞 泡桐葉;熊果酸;超聲波輔助;提取;正交試驗(yàn)

Abstract [Objective]In order to provide a basis for the development and utilization of ursolic acid from Paulownia tomentosa， ultrasonic assisted extraction was adopted to extract the ursolic acid from Paulownia tomentosa. [Method] The efects of ethanol concentration， extraction time， extraction temperature， solidliquid ratio， ultrasonic power and extraction times on the yield of ursolic acid were studied by single factor and orthogonal experiments. [Result]The optimum extraction conditions of ursolic acid from Paulownia tomentosa leaves were determined by variance analysis and validation test， the concentration of ethanol was 90%， the solidliquid ratio was 1：20， the extraction time was 40 min， the extraction temperature was 65 ℃， the extraction times was 3 times， and the ultrasonic power was 350 W. Under the condition of the extraction process， the ursolic acid yield was 0.742%. [Conclusion]Ultrasound extraction is a popular method to extract ursolic acid with high efficiency， mild conditions and simple operation.

Key words Paulownia tomentosa leaves;Ursolic acid;Ultrasonicassisted;Extraction;Orthogonal experiment

熊果酸（ursolic acid），別名烏索酸和烏蘇酸。純品是棱柱狀或細(xì)毛樣針狀結(jié)晶，有光澤，粗品為黃綠色或棕黃色粉末，有特殊氣味，是存在于天然植物中的一種五環(huán)三萜類化合物[1]，具有抗癌[2]、抗氧化美白[3]、抗菌抗炎[4]、降糖[5]等多種藥理作用，目前備受關(guān)注。有關(guān)熊果酸的提取近年來已成為天然產(chǎn)物開發(fā)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，我國泡桐資源豐富，熊果酸又是其主要的功能性成分之一[6]，從泡桐中提取熊果酸，充分利用泡桐資源，具有重要意義。

熊果酸的提取方法很多，目前從各種原料中提取熊果酸的方法主要有回流提取法[7]、索氏提取[8]、浸提法[9]、超聲波提取法[10]、微波提取[11]、超臨界萃取法[12]、亞臨界水萃取[13]、雙水相萃取法[14]、常溫超高壓提取法[15]、沉淀吸附法[16]、微波預(yù)處理-回流提取聯(lián)合工藝法[17]等。實(shí)驗(yàn)室常用的主要是回流法、索氏提取法、微波輔助提取以及超聲輔助法，其中微波提取法升溫較快，對產(chǎn)物生物活性不利，而回流提取法、浸提法和索氏提取所用時(shí)間較長、效率低下，其他方法如超臨界流體萃取等萃取法和超高壓提取法等對設(shè)備要求高、成本高。因此該研究主要采用超聲輔助提取法，鑒于目前熊果酸提取的影響因素缺少全面研究，大多只研究了乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和溫度4個(gè)因素[7-11]，提取所用溶劑主要是乙醇，少數(shù)用甲醇[18-19]和丙酮[20]。該研究以毛泡桐（P.tomentosa（Thunb.）Steud）葉為原料，采用超聲波輔助提取法，通過單因素和正交試驗(yàn)研究乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)、提取溫度以及超聲波功率對熊果酸得率的影響，以期為毛泡桐葉熊果酸的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試材

泡桐（P.tomentosa（Thunb.）Steud）葉采摘于廣西師范大學(xué)南苑，清洗干凈，40 ℃烘干，粉碎過40目篩備用;熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品（AR）購于廣州分析測試中心科力技術(shù)開發(fā)公司;95%乙醇（AR）、無水乙醇（AR）、甲醇（色譜級）均購于西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器

KQ-500VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司）;2K-82（AB）型真空干燥箱（鄭州長城科貿(mào)有限公司）;2F-2型三用紫外分析儀（上海市安亭電子儀器廠）;日本島津系統(tǒng)高效液相色譜儀，包括CBM-20A控制器、LC-20雙泵、SPD-20AC檢測器。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 熊果酸含量的測定——HPLC法。

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。準(zhǔn)確稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，用甲醇定容至5 mL，制成熊果酸質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密吸取該溶液0.10、0.20、0.40、0.50、0.75 mL加甲醇定容至10 mL，配制成0.010、0.020、0.040、0.050、0.075 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液[21] 。

（2）色譜條件。色譜柱為Waters SunFireTM C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相為甲醇-磷酸水溶液（88∶12，V/V，pH=3），檢測波長210 nm;流速0.8 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量20 μL。此條件下，熊果酸與其他成分分離度較好（R>1.2），理論塔板數(shù)不低于7 000。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）、熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到熊果酸峰面積與熊果酸濃度的關(guān)系為：Y=1.123×107X-3.39×104。

1.3.1.2 供試樣品溶液的制備。

精確稱取經(jīng)提取分離并干燥的熊果酸粗品5.0 mg，用甲醇定容至100 mL，配制成0.05 mg/mL的粗品溶液，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾，取濾液為供試液。

1.3.1.3 熊果酸得率的計(jì)算。其公式如下：

熊果酸得率=（提取液中熊果酸的質(zhì)量/泡桐葉粉末的質(zhì)量）×100%（1）

1.3.2 超聲波輔助提取最佳提取工藝的確定。

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)。

泡桐葉粉末經(jīng)水煮沸10 min以除去水溶性雜質(zhì)后，抽濾，收集濾渣冷凍干燥備用。精確稱取10.00 g的濾渣，采取超聲波輔助提取，分別考察乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取次數(shù)（C）、提取時(shí)間（D）、超聲波功率（E）、 提取溫度（F）對熊果酸得率的影響，將所得提取物進(jìn)行初步純化后測定其中熊果酸含量，方法同“1.3.1.1”。各因素水平的設(shè)置參考相關(guān)文獻(xiàn)[10]，詳見表1。

1.3.2.2 正交試驗(yàn)。

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上固定對試驗(yàn)結(jié)果影響小的提取溫度、提取時(shí)間和超聲波功率，選擇對試驗(yàn)結(jié)果影響大的乙醇濃度、料液比和提取次數(shù)3個(gè)因素，按L9（34）[22]進(jìn)行正交試驗(yàn)，其因素水平設(shè)置詳見表2。

1.3.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)。將正交試驗(yàn)極差分析所得的最優(yōu)方案、正交表中結(jié)果最好的方案以及方差分析得出的方案進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波輔助提取單因素試驗(yàn)

各因素對熊果酸得率的影響如圖1所示，乙醇濃度、料液比和提取次數(shù)對熊果酸得率影響較明顯，而提取時(shí)間、提取溫度以及超聲波功率對熊果酸得率的影響不明顯，得率隨因素變化的范圍僅在0.1%左右。故正交試驗(yàn)中主要研究乙醇濃度、料液比和提取次數(shù)對熊果酸得率的影響。另外在乙醇濃度、料液比的整個(gè)區(qū)間范圍內(nèi)，熊果酸的得率隨著參數(shù)值的增大一直呈上升趨勢，故正交試驗(yàn)中需要提高這2個(gè)因素的上限值。而提取時(shí)間、提取溫度、超聲波功率以及提取次數(shù)對熊果酸得率的影響中，得率先上升后有所下降，當(dāng)溫度為65 ℃時(shí)，再提高溫度熊果酸得率反而下降，所以選65 ℃為最佳提取溫度;當(dāng)提取時(shí)間超過40 min后，熊果酸得率開始下降，故選40 min為最佳提取時(shí)間;當(dāng)超聲波功率為350 W時(shí)，增加超聲波功率熊果酸得率卻下降，故選超聲波最佳功率為350 W。

2.2 正交試驗(yàn)

固定提取溫度65 ℃、提取時(shí)間40 min、超聲波功率350 W，對乙醇濃度、料液比和提取次數(shù)進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。通過極差分析得出3個(gè)因素對熊果酸得率影響從大到小依次為提取次數(shù)、料液比、乙醇濃度，最優(yōu)方案為A2B3C3。而方差分析顯示，在給出的水平范圍內(nèi)，料液比和乙醇濃度對熊果酸得率的影響均不顯著（FA F0.05），選擇最佳水平，所以確定熊果酸的最佳提取方案為A1B1C3。而正交表中結(jié)果最好的方案是A1B3C3。

2.3 驗(yàn)證結(jié)果

3組試驗(yàn)的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，A1B3C3、A1B1C3、A2B3C3試驗(yàn)方案所得熊果酸得率分別為0.740%、0.742%、0.749%，3種方案所得熊果酸得率差異都很小，故選擇方差分析推測的方案A1B1C3，即熊果酸的最佳提取條件為乙醇濃度90%、料液比1∶20、提取次數(shù)3次、提取時(shí)間40 min、提取溫度65 ℃、超聲波功率350 W，在此條件下熊果酸的得率為0.742%。

3 小結(jié)

超聲法提取相對于回流提取和索氏提取效率高、溫度低，也比微波提取升溫慢，利于保護(hù)物質(zhì)活性，相對于超臨界流體萃取法等[12-15]成本低、操作簡單，故是一種比較適宜的大眾化的提取熊果酸的方法。超聲法提取中，在一定條件下，乙醇濃度、料液比和提取次數(shù)對熊果酸得率影響較大，超聲功率、提取時(shí)間和提取溫度對試驗(yàn)結(jié)果影響較小。故實(shí)際提取時(shí)，本著保護(hù)物質(zhì)活性、節(jié)約成本和提高效率的基礎(chǔ)上，主要考慮乙醇濃度、料液比和提取次數(shù)三因素。需要指出的是試驗(yàn)因素的主次順序與選取的水平有關(guān)，如果因素水平選取發(fā)生改變，因素的主次順序可能隨著改變。在單因素試驗(yàn)中，各因素水平跨度相對較大，乙醇濃度、提取次數(shù)、料液比對試驗(yàn)結(jié)果影響明顯;而在正交試驗(yàn)時(shí)，對乙醇濃度和料液比的水平范圍縮小以期找出更準(zhǔn)確的參數(shù)時(shí)，提取次數(shù)成為了影響相對最顯著的因素。

該研究采用超聲輔助法，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)分析了影響熊果酸得率的六大因素，并找出了毛泡桐葉超聲提取熊果酸的最佳提取參數(shù)，為熊果酸的提取和泡桐資源的開發(fā)利用奠定了理論基礎(chǔ)，但研究中并未考慮各因素間的交互作用，故若需要得到更詳細(xì)和準(zhǔn)確的試驗(yàn)數(shù)據(jù)則需要做更進(jìn)一步的研究。

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