許佳敏 邊海霞 周云鋒/寧夏曉鳴農(nóng)牧股份有限公司 750001

關(guān)鍵字：銅綠假單胞菌； 消毒劑；篩選

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa， Pa)，俗稱綠膿桿菌，廣泛存在于環(huán)境中，為一類條件性致病菌。綠膿桿菌?？蓮碾u群及養(yǎng)殖場中分離到，尤其當(dāng)雞群處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，極易感染，且致死率在 1%～90%，所以合理選用消毒劑對其消滅和防控極為重要。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 樣品孵化絨毛。

1.1.2 試劑安立消，由瑞普（天津）生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；安滅殺，由默沙東動(dòng)物保健品有限公司生產(chǎn)；衛(wèi)可，由英國安德國際有限公司生產(chǎn)；百勝，由英國 Evans 生產(chǎn)廠生產(chǎn)； 醛立潔、二氯異氰尿酸鈉、三氯異氰尿酸鈉由寧夏智弘生物有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 培養(yǎng)基普通肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂平皿由北京路橋生物有限公司生產(chǎn)；十六烷三甲基溴化銨瓊脂由青島高科園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.1.4 儀器生化培養(yǎng)箱由上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)；立式雙層智能精密性搖床由上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)；潔凈工作臺由蘇州尚田潔凈有限公司生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1 細(xì)菌分離及鑒定無菌取絨毛0.1g加入10mL生理鹽水，充分混合，作為10-2樣品，以 10 倍稀釋進(jìn)行10-3、10-4樣品稀釋，稀釋后充分混勻，分別取10-2、10-3、10-4樣品1mL，采用傾注法接種十六烷基三甲基溴化銨瓊脂（銅綠假單胞菌鑒別培養(yǎng)基），置于37℃培養(yǎng)16～30h。挑取典型菌落，與LB肉湯培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。按照以上操作純化3次，取菌液1mL，提取DNA，16S 通用引物，進(jìn)行PCR，將所得產(chǎn)物進(jìn)行送檢測序。

1.2.2 配置菌株懸液選取已純化3次的單菌落接種到LB肉湯中，37℃震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，制備濃度為1.0×108CFU/mL的菌懸液。

1.2.3 菌液定量殺菌試驗(yàn)

1.2.3.1 消毒劑的稀釋 根據(jù)各消毒劑推薦的濃度將其稀釋2 倍、10 倍、100 倍。

1.2.3.2 試驗(yàn)步驟 取稀釋好的各消毒劑 5mL，分別加0.1mL的銅綠假單胞菌，混勻，室溫孵育10min，30min，分別取 0.2mL涂布于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。放于37℃溫箱中培養(yǎng)24h，觀察計(jì)數(shù)。試驗(yàn)每組重復(fù)3次。同時(shí)，設(shè)立陰陽對照組，陰性對照不加培養(yǎng)菌液，陽性對照不加消毒劑。

表1 不同濃度消毒劑作用不同時(shí)間后細(xì)菌殺滅率

1.2.4 同一消毒劑不同濃度，消毒后不同時(shí)間內(nèi)孵化銅綠假單胞菌的檢測根據(jù)之前實(shí)驗(yàn)室測定數(shù)據(jù)確定消毒藥濃度，噴灑或擦拭物體表面，在消毒前、消毒后采集棉拭子，測定銅綠假單胞菌含量，進(jìn)一步評定消毒藥濃度范圍及消毒間隔。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果細(xì)菌經(jīng)染色、培養(yǎng)特性，結(jié)合產(chǎn)色素特點(diǎn)初步鑒定為綠膿桿菌。16S 基因測序經(jīng)過Blast分析對比后，與銅綠假單胞菌各菌株16sRNA序列同源性為99%以上。進(jìn)一步驗(yàn)證分離的菌株為銅綠假單胞菌。

2.2 菌液定量殺菌試驗(yàn)結(jié)果（見表1）

從表1可以結(jié)果看出，銅綠假單胞菌對消毒劑敏感性順序?yàn)椋毫⑾饺犬惽枘蛩徕c＞安滅殺＞百勝＞衛(wèi)可＞醛立潔＞二氯異氰尿酸鈉。

2.3 同一消毒劑不同濃度，消毒后不同時(shí)間內(nèi)孵化銅綠假單胞菌的檢測 使用已篩選消毒劑最高稀釋度及次之稀釋度噴灑、擦拭孵化場發(fā)現(xiàn)，安立消、三氯異氰尿酸鈉、安滅殺、百勝對其殺滅效果更有效。這與實(shí)驗(yàn)室篩選濃度相符。

3 討 論

有研究表明表面活性劑類具有殺菌和去污作用，對綠膿桿菌、真菌有效[1]。在本試驗(yàn)中表面活性劑類消毒劑對本場區(qū)綠膿桿菌殺滅效果最好。同樣張媛等表明表面活性劑類消毒劑新潔爾滅對綠膿桿菌殺滅效果良好[2]。氯類、醛類消毒藥三氯異氰尿酸鈉、安滅殺對其殺滅效果也較好，但是因二氯異氰尿酸鈉長期使用已耐藥，效果不理想。這與鄧晶榮等實(shí)驗(yàn)相符。鄧晶榮等表明聚維酮碘、戊二醛、三氯異氰尿酸能夠有效滅殺多耐藥銅綠假單胞菌， 低濃度的聚維酮碘與三氯異氰尿酸能夠在5min內(nèi)有效滅殺該細(xì)菌，而低濃度的戊二醛比聚維酮碘、三氯異氰尿酸的5min滅殺細(xì)菌的效果要差[3]。百勝主要成分為碘、磷酸、硫酸對綠膿桿菌殺滅效果也較好。而醛立潔、衛(wèi)可、二氯異氰尿酸鈉消毒效果不理想。所以合理選擇和正確使用化學(xué)消毒劑，確保消毒效果至關(guān)重要。