重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胃腸外科，重慶 400016

結直腸癌是一種消化道常見惡性腫瘤，近年來發(fā)病率呈明顯上升趨勢，根據(jù)國家癌癥中心2015年癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)，中國結直腸癌的發(fā)病率和死亡率均位列第5位［1］。上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮細胞在特定的生理和病理情況下極性消失，黏附力下降，骨架重塑，轉變成運動能力增強的間質樣上皮的現(xiàn)象。它不僅與胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷修復密切相關，而且新近研究表明，它是腫瘤細胞發(fā)生侵襲和轉移的關鍵啟動步驟［2］。而腫瘤轉移又是影響患者預后不良的關鍵問題，因此深入研究EMT發(fā)生的分子機制顯得尤為重要。膠質瘤相關癌基因同源蛋白2（glioma-associated oncogene homologue 2，GLI2）作為Hedgehog（Hh）信號通路重要的轉錄因子，具有轉錄激活Hh通路的作用，它不僅對細胞分化與器官發(fā)育調節(jié)有重要作用，而且最新研究發(fā)現(xiàn)它在多種腫瘤細胞中異常激活，參與腫瘤增殖和轉移的惡性進程［3］。但目前在結腸癌中關于GLI2與EMT關系的研究較少，本研究擬探討GLI2與結腸癌細胞系SW620的EMT的關系，進一步闡明結腸癌EMT發(fā)生的分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料和細胞系

SW620、SW480、HCT116、HT29和HUⅤEC 細胞系由重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院中心實驗室提供。干擾人GLI2 的慢病毒（shRNA：5’-GATCTGGACAGGGATG ACT-3’）和空載體慢病毒（shRNA：5’-TTCTCC GAACGTGTCACGT-3’）購自上海紐恩生物科技有限公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）相關試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，抗人GLI2抗體購自美國Santa Cruz公司，抗人p-AKT抗體購自美國Cell Signaling公司，抗人N-cadherin、vimentin、MMP2和E-cadherin抗體、鼠抗人GAPDH抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔和羊抗鼠二抗購自武漢三鷹生物技術有限公司，Matrigel基質膠購自美國Becton Dickinson公司，蛋白質印跡法（Western blot）相關試劑購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

細胞用含10%胎牛血清、5%青霉素-鏈霉素雙抗RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 RTFQ-PCR檢測細胞mRNA表達

細胞常規(guī)培養(yǎng)72 h后，按說明書用TRIzol法抽提各組RNA、逆轉錄獲得cDNA，再用SYBY熒光定量試劑盒進行PCR實時擴增，反應在CFX 96型RTFQ-PCR儀上進行，條件：預變性95 ℃ 30 s，然后95 ℃ 5 s，60℃30 s，反應40個循環(huán)，結果以2-ΔΔCt值表示待測樣本基因表達量相對于校準樣本基因表達量的倍數(shù)。各引物序列如下：E-cadherin上游引物為5’-TGGCTTCCCTCTTTCATCTCC-3’，下游引物為5’-TCATAGTTCCGCTCTGTCTTTGG-3’，GLI2 上游引物為5’-GGTGTATCCCACGGAAAGCA-3’，下游引物為5’-AAAGCCTAACTGGCATCCTCC-3’；GAPDH上游引物為5’-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3’，下游引物為5’-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3’，實驗重復3次。

1.2.3 分組及慢病毒感染

實驗設干擾組（感染干擾慢病毒）、空病毒組（感染空病毒）、對照組（SW620細胞）。取對數(shù)生長期細胞，調整細胞成1×106個/mL，鋪6孔板（每組設3個復孔），每孔鋪2×105個細胞，細胞貼壁后，以MOI 30加入GLI2干擾慢病毒和空載體慢病毒，每孔液體總容量保持在1 mL，每孔加入5 μg的Polybrene，24 h后換夜，72 h后用熒光顯微鏡攝像。

1.2.4 Transwell小室檢測細胞侵襲及遷移能力

侵襲實驗：將Matrigel基質膠用無血清培養(yǎng)基1∶3稀釋后取40 μL鋪Transwell小室（8 μm）上室，紫外線照射過夜，實驗前用無血清培養(yǎng)液水化，各組取400 μL細胞懸液加入上室，下室加10%胎牛血清培養(yǎng)液600 μL，常規(guī)培養(yǎng)24 h，擦去上室基質膠和細胞，多聚甲醛固定，結晶紫染色、封片，顯微鏡下計數(shù)5個視野平均穿膜細胞數(shù)。遷移實驗：上室內(nèi)不鋪膠，余操作同前，實驗重復3次。

1.2.5 黏附實驗

取對數(shù)生長期的SW620和HUⅤEC細胞制成細胞懸液，分別取100 μL/1×105個SW620和HUⅤEC細胞接種于96孔板除第1、7、12列的A～C排孔和E～G排孔，培養(yǎng)至細胞基本鋪滿孔板底部；取空病毒組細胞100 μL/1×105個加至96孔板第3至7列除D排的A～G孔內(nèi)，等量干擾組細胞加入第8～12列除D排的A～G孔內(nèi)，每隔30 min吸出3、8列，4、9列，5、10列，6、11列所有孔上清液，120 min后離心，吸出2、7、12列所有孔內(nèi)上清液，吸出后每孔用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate-buffered saline，PBS）液輕洗，每孔加入100 μL無血清培養(yǎng)基后再加入20 μL MTT，4 h后離心去上清液后每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），即在570 nm波長處測吸光度（D）值；計算同（異）種黏附率=［D同(異)種各時間段-D同（異）種空白組］/D空病毒組或干擾組，對照組黏附能力變化檢測同上，實驗重復3次。

1.2.6 Western blot檢測細胞GLI2、p-AKT、N-cadherin、vimentin、MMP2和E-cadherin蛋白水平

將各組細胞裂解后取上清液，用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法定量。每孔加等量蛋白樣品，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠電泳，然后電轉至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PⅤDF膜）后封閉2 h，加入稀釋后的一抗：抗GLI2抗體（1∶1 000）、抗p-AKT抗體（1∶1 000）、抗MMP-2抗體（1∶500）、抗N-cadherin抗體（1∶500）、抗vimentin抗體（1∶500）、抗E-cadherin抗體（1∶500）和抗GAPDH抗體（1∶2 000），4 ℃溫育過夜，TBST洗膜，加入對應二抗，室溫1.5 h，漂洗后用ECL發(fā)光試劑盒顯影。凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，以目的蛋白與GAPDH的灰度值比值代表目的蛋白的表達水平，實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件，所有數(shù)據(jù)用表示，多組之間比較采用單因素方差分析，兩組之間的比較采用最小顯著差別（least significant difference，LSD）法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 E-cadherin在4組細胞系中的表達情況

SW620與SW480、HCT116、HT29 細胞系相比E-cadherin mRNA表達量最低（P＜0.05，圖1）。E-cadherin表達減少是細胞發(fā)生EMT最主要的標志。故本實驗選取該SW620進行后續(xù)研究。

圖1 4組細胞系E-cadherin mRNA相對表達量Fig.1 The relative expression of E-cadherin mRNA in the four groups

2.2 重組慢病毒感染效果判定

熒光顯微鏡觀察顯示，感染干擾慢病毒和空載體慢病毒72 h后，兩組SW620細胞均可見綠色熒光表達，轉染效率均達90%以上（圖2）。干擾組GLI2 mRNA的表達量約為對照組的0.31倍（P＜0.05），蛋白的相對表達量約為對照組的0.44倍（P＜0.05，圖3）。

2.3 細胞侵襲和遷移能力情況

侵襲實驗發(fā)現(xiàn)，干擾組穿膜細胞數(shù)（57.5±4.6）明顯少于對照組（8 7.8±8.2）和空病毒組（80.3±4.8）（P＜0.05）。遷移實驗發(fā)現(xiàn)，干擾組組穿膜細胞數(shù)（156.1±7.5）明顯少于于對照組（241.2±13.4）和空病毒組（224.8±10.6）（P＜0.05，圖4～5）。侵襲和遷移實驗中，對照組與空病毒組相比差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 干擾慢病毒感染SW620的熒光圖像Fig.2 Fluoroscopic image of SW620 infected with interference lentivirus

圖3 干擾慢病毒感染SW620后GLI2表達變化Fig.3 Expression of GLI2 in SW620 after infection with interference lentivirus

圖4 3組細胞侵襲能力比較Fig.4 Comparison of the invasion ability in the three groups

圖5 3組細胞遷移能力比較Fig.5 Comparison of the migration ability in the three groups

2.4 細胞黏附率情況

在波長570 nm下測量D值算出各時段細胞間黏附率。結果顯示，干擾細胞在90和120 min時間點的同種細胞黏附率高于對照組和空病毒組（P＜0.05），在60、90和120 min時間點的異種細胞黏附率低于對照組和空病毒組（P＜0.05，表1）。

2.5 Western blot檢測p-AKT、E-cadherin、N-cadherin、vimentin和MMP2蛋白的表達。

干擾組p-AKT、N-cadherin、vimentin和MMP2蛋白表達量均低于對照組和空病毒組（P＜0.05），E-cadherin蛋白表達量高于對照組和空病毒組（P＜0.05，圖6）。

表1 同種及異種細胞間黏附率的比較Tab.1 Comparision of intercellular adhesion rate between the homogeneous and heterogeneous cells(,N=3)

表1 同種及異種細胞間黏附率的比較Tab.1 Comparision of intercellular adhesion rate between the homogeneous and heterogeneous cells(,N=3)

*:P＜0.05,compared with control group and empty vector group

圖6 各組細胞p-AKT、E-cadherin、N-cadherin、vimentin和MMP2蛋白的表達Fig.6 The protein expressions of p-AKT,E-cadherin,N-cadherin,vimentin and MMP2 in each group

3 討 論

腫瘤轉移是指腫瘤細胞脫離原發(fā)生長部位，通過各種轉運途徑，在遠離原發(fā)灶處形成同質腫瘤的過程，它是影響患者預后最主要的因素。這個過程極其復雜，涉及細胞之間黏附能力改變，細胞外基質的降解以及細胞運動能力的改變等各個方面。EMT作為浸潤遷移過程中的重要現(xiàn)象，已被證實是腫瘤轉移的重要機制之一［4］。上皮細胞發(fā)生EMT后，細胞由上皮樣表型向間質表型轉換，維持上皮細胞之間黏附的上皮標志物E-cadherin等表達水平會降低，間質細胞表型標志物vimentin、N-cadherin等表達水平增加［5］。這些生物學標志的改變會使得細胞骨架重構，細胞極性和黏附力改變，運動能力增強，從而發(fā)生轉移。

Hh信號通路是近年來腫瘤領域研究熱點之一，Hh信號通路由Hh信號多肽、跨膜蛋白受體、跨膜蛋白及轉錄因子GLI等組成［6］。該通路不僅能夠參與正常組織的增殖和分化，而且它的異常激活還與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關［7］。它通過與Notch、phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、RAS等多種信號通路交聯(lián)，共同促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［8］。GLI作為Hh信號通路終末轉錄因子，是Hh信號通路產(chǎn)生效應的關鍵，GLI蛋白進入細胞核后，通過對下游靶基因的調節(jié)來影響惡性腫瘤的發(fā)展，GLI2作為既有激活功能又有抑制功能的關鍵因子受到越來越多研究者的重視。有研究者發(fā)現(xiàn)，GLI2可以通過轉錄激活下游的ARHGEF16來促進人膠質瘤細胞的增殖和轉移［9］。Yue等［10］同樣發(fā)現(xiàn)Shh/GLI信號通路還能通過促進肺癌細胞發(fā)生EMT來促進腫瘤細胞的轉移。但是目前關于GLI2與結腸癌EMT及轉移的關系仍不清楚。

為探討GLI2對結腸癌細胞的EMT及轉移能力的影響，本研究首先對4種人結腸癌細胞系SW620、SW480、HCT116和HT29中E-cadherin mRNA表達進行檢測，發(fā)現(xiàn)E-cadherin在SW620中的表達明顯降低，而E-cadherin是介導上皮細胞間黏附的標志分子，它表達減少是細胞發(fā)生EMT最主要的標志，這說明來自于淋巴轉移灶的SW620細胞發(fā)生了較為明顯的EMT，故實驗選取該細胞系進行后續(xù)研究。然后研究者用重組慢病毒沉默了SW620細胞中GLI2的表達后發(fā)現(xiàn)，上皮細胞標志分子E-cadherin的表達水平顯著增高，而間質細胞標志分子N-cadherin及vimentin 表達水平降低，這提示沉默SW620細胞GLI2的表達可以一定程度上逆轉SW620細胞的EMT，研究者再通過transwell侵襲和遷移實驗、黏附實驗發(fā)現(xiàn)，干擾組細胞的侵襲、遷移能力減弱，同種細胞間黏附力增強，異種細胞間黏附力減弱，這提示GLI2能通過促進SW620細胞發(fā)生EMT來增強細胞的侵襲和遷移能力，最終導致腫瘤轉移。

為進一步探討GLI2促進SW620細胞發(fā)生EMT的機制，實驗檢測了細胞內(nèi)p-AKT和MMP-2的表達情況，發(fā)現(xiàn)干擾組的p-AKT和MMP-2表達較對照組明顯降低。p-AKT作為PI3K/AKT信號通路的核心分子，是該通路發(fā)揮生物學效應的關鍵。PI3K/AKT信號通路廣泛存在于各種腫瘤中，它的異常激活與腫瘤的轉移密切相關［11］。PI3K/AKT信號通路可以通過上調snail、twist等核轉錄因子和基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表達，與Wnt、Notch等信號通過相互作用誘導EMT發(fā)生［12］。研究者發(fā)現(xiàn)Hh信號通路可以通過PI3K/AKT信號通路上調MMP-2、MMP-9 的表達來促進膠質瘤細胞的侵襲轉移［13］。MMP-2是基質金屬蛋白酶中重要的一員，它可以通過降解基底膜和細胞外基質來促進腫瘤細胞侵襲轉移。Xiang等［14］發(fā)現(xiàn)抑制GLI2的表達能夠通過MAPK/ERK通路下調MMP-2的表達從而降低細胞侵襲遷移能力。以上研究與本研究有相似之處。由此推測，在結腸癌SW620細胞系中GLI2可能通過促進細胞EMT的進程，參與腫瘤細胞的侵襲轉移，其機制可能與p-AKT、N-cadherin、vimentin、MMP-2表達上調和E-cadherin表達下調相關。

EMT的發(fā)生涉及多種轉錄因子和信號通路，是一個復雜的網(wǎng)絡結構，它影響腫瘤發(fā)生侵襲和轉移的具體機制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，在結腸癌SW620細胞系發(fā)生EMT的過程中可能涉及Hh/GLI通路和PI3K/Akt通路的關聯(lián)，研究者將在后續(xù)研究中進一步通過特異性阻斷Hh通路和PI3K/AKT通路，探討二者與結腸癌細胞EMT發(fā)生的關系，以期進一步揭示結腸癌EMT發(fā)生的分子機制。