成麗琴

(通山縣中醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 通山 437600)

在全球范圍內(nèi)，宮頸癌是女性第二大常見(jiàn)惡性腫瘤，其發(fā)病僅次于乳腺癌，嚴(yán)重威脅女性的生命健康安全[1]。目前臨床上治療宮頸癌主要以手術(shù)結(jié)合化療為主，但是長(zhǎng)期以來(lái)宮頸癌患者病死率仍未見(jiàn)顯著降低?；熕幬镌跉[瘤細(xì)胞的同時(shí)，也給機(jī)體組織帶來(lái)極大的損傷，其對(duì)黏膜、心臟、肝臟、肺、泌尿系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚等均具有毒性反應(yīng)，此外還可能引起過(guò)敏反應(yīng)、靜脈炎甚至抑制骨髓導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，造成嚴(yán)重并發(fā)癥[2-3]。

經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)幾千年的篩選與實(shí)踐，中藥以其低毒、安全性和有效性被視為現(xiàn)代藥物開(kāi)發(fā)的寶庫(kù)。葛根素是從葛根中提取出的異黃酮類化合物，具有抗炎、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)的作用，臨床常用于治療心腦血管疾病。越來(lái)越多的研究表明葛根素具有顯著的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[4]，但對(duì)其誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡及其相關(guān)機(jī)制的研究不甚明了。本文擬探討葛根素對(duì)Hela細(xì)胞行為學(xué)的作用及IL-6相關(guān)通路蛋白表達(dá)的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與細(xì)胞株

葛根素購(gòu)自sigma公司,溶于DMSO后儲(chǔ)存液濃度100mmol/L。宮頸癌Hela細(xì)胞系購(gòu)自武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

DMSO購(gòu)自上海翌圣生物科技有限公司，DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、PBS磷酸鹽緩沖液、青-鏈霉素雙抗購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 生物公司。細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自BD公司。IL-6 Elisa試劑盒、抗-STAT3、抗-Bcl2、抗-GAPDH抗體購(gòu)自Proteintech公司。p-STAT3抗體購(gòu)自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

宮頸癌Hela細(xì)胞株于5% CO2、37℃恒溫恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液。每?jī)商鞊Q液一次，細(xì)胞融合度達(dá)80%左右后，用含EDTA的胰蛋白酶消化液進(jìn)行消化后傳代。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好且無(wú)污染的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力

將Hela細(xì)胞接種于96孔板，血清饑餓24h后分別加入含不同濃度葛根素(0、10、20、40μmol/L)的培養(yǎng)液中處理Hela細(xì)胞24、48、72h，每組各設(shè)3個(gè)平行對(duì)照孔。加入CCK-8試劑后于37℃環(huán)境中孵育1.5h，使用酶標(biāo)儀于450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光值并計(jì)算細(xì)胞增殖活力。細(xì)胞活力(%)=實(shí)驗(yàn)組吸光值/對(duì)照組吸光值×100%。

1.2.3 細(xì)胞凋亡測(cè)定

濃度梯度葛根素作用于Hela細(xì)胞24、48、72h后，使用不含EDTA胰酶消化細(xì)胞，同時(shí)收集上清液中的細(xì)胞，離心后PBS清洗一遍后100μL 1×Annexin V結(jié)合液重懸，每組細(xì)胞分別加入5μL PE、5μL 7-AAD，室溫下孵育15min后另加入400μL 1×Annexin V結(jié)合液，混勻后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡狀態(tài)。通過(guò)Flow Jo軟件對(duì)細(xì)胞凋亡率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 Elisa法測(cè)定IL-6含量

每孔取100μL細(xì)胞培養(yǎng)液上清液于96孔板，每組設(shè)3個(gè)平行對(duì)照孔，同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)品及培養(yǎng)液對(duì)照。按照說(shuō)明書步驟進(jìn)行操作，最后于酶標(biāo)儀上讀取96孔板每孔相應(yīng)的OD值(450nm)。實(shí)驗(yàn)組OD值=每孔OD值-空白孔OD值；最后使用實(shí)驗(yàn)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并求出相應(yīng)位置樣本中細(xì)胞因子含量。

1.2.5 Western blot檢測(cè)Hela細(xì)胞信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

濃度梯度葛根素作用于細(xì)胞72h，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞并使用BCA法測(cè)定總蛋白濃度。取細(xì)胞裂解液50μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳完畢后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，2%BSA封閉液封閉1h，分別加入STAT3、p-STAT3、Bcl2、GAPDH一抗溶液4℃孵育過(guò)夜，第二日于37℃二抗溶液中孵育1h，滴加ECL曝光液并于成像系統(tǒng)中成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 葛根素對(duì)Hela細(xì)胞增殖能力的影響

和對(duì)照組(0μmol/L)比較，隨著作用時(shí)間的增加，10、20、40μmol/L的葛根素均可明顯降低細(xì)胞的增殖活性，且在72h時(shí)作用效果最為顯著，因此選擇72h為葛根素的作用時(shí)間，見(jiàn)圖1。

與對(duì)照組(0μmol/L)比較，*P<0.05，n=3

2.2 葛根素對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響

0、10、20、40μmol/L的葛根素處理細(xì)胞72h后，細(xì)胞凋亡率(%)分別為11.97±1.00、14.43±1.00、33.25±1.65、44.8±4.25。與對(duì)照組(0μmol/L)比較，10、20、40μmol/L葛根素處理均能夠明顯提高細(xì)胞凋亡狀態(tài)，細(xì)胞凋亡水平同葛根素作用濃度呈正相關(guān)，見(jiàn)圖2。

與對(duì)照組(0μmol/L)比較，*P<0.05，n=3

2.3 葛根素對(duì)Hela細(xì)胞外IL-6含量的影響

分別使用10、20、40μmol/L的葛根素處理Hela細(xì)胞72h后，使用Elisa法測(cè)定細(xì)胞外培養(yǎng)基中IL-6變化情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，葛根素可顯著降低細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-6含量，隨著葛根素濃度增高，其降低IL-6效果越顯著，見(jiàn)圖3。

與對(duì)照組(0μmol/L)比較，*P<0.05，n=3

2.4 葛根素對(duì)Hela細(xì)胞中IL-6信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

分別使用10、20、40μmol/L的葛根素處理Hela細(xì)胞72h后，通過(guò)Western blot檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)表達(dá)。結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，葛根素濃度≥10μmol/L時(shí)，宮頸癌Hela細(xì)胞中p-STAT3/STAT3以及Bcl2蛋白的表達(dá)水平以濃度梯度依賴的方式顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組(0μmol/L)比較，STAT3蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖4。

圖4 不同濃度葛根素對(duì)Hela細(xì)胞內(nèi)IL-6信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

宮頸癌是發(fā)展中國(guó)家女性最常見(jiàn)的腫瘤之一，其發(fā)生僅次于乳腺癌[5]。葛根素又名異單酮，是從葛根中提取出來(lái)的單體成分，具有抗炎、抗衰老、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、改善微循環(huán)等多種作用，在心血管疾病的治療中應(yīng)用廣泛[6]。近年來(lái)研究表明葛根素還具有抗腫瘤作用，對(duì)卵巢癌[7]、乳腺癌[8]、宮頸癌[9]等惡性腫瘤具有顯著的抑制作用，但其對(duì)宮頸癌細(xì)胞作用的具體機(jī)制研究較少。

大量研究已經(jīng)證實(shí)炎癥與腫瘤存在明顯關(guān)系，其中促炎性細(xì)胞因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著強(qiáng)力的影響。IL-6已被證實(shí)在宮頸于宮頸上皮細(xì)胞促進(jìn)其生長(zhǎng)及放化療抵抗[10]，其下游STAT3轉(zhuǎn)錄因子在大多數(shù)惡性腫瘤中高表達(dá)，磷酸化水平增高。二磷酸化后的p-STAT3可入核激活多種基因的啟動(dòng)子從而促進(jìn)如增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等腫瘤惡性行為的發(fā)生。因此，IL-6/STAT3信號(hào)通路可作為抗腫瘤治療與研究中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。有研究表明，葛根素能有效降低糖尿病腎病患者血清中炎癥因子癌進(jìn)展中起促進(jìn)作用，其可通過(guò)自分泌與旁分泌促進(jìn)宮頸癌相關(guān)成纖維細(xì)胞衰老，或者作用IL-6表達(dá)水平，通過(guò)控制炎癥改善患者24h尿量微蛋白水平[11]。因此，IL-6/STAT3通路可能是葛根素作用于惡性腫瘤的重要途徑。

腫瘤治療的關(guān)鍵是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和/或抑制腫瘤細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)、Elisa、Western blot等證明了葛根素對(duì)宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞具有明顯抑制作用。不同濃度的葛根素對(duì)Hela細(xì)胞的增殖均具有明顯的抑制作用，并且表現(xiàn)為明顯的濃度與時(shí)間效應(yīng)，40μmol/L的葛根素對(duì)Hela細(xì)胞的抑制作用最為顯著。同時(shí)各濃度葛根素均可明顯促進(jìn)Hela細(xì)胞凋亡，40μmol/L葛根素對(duì)凋亡促進(jìn)作用最明顯，Western blot結(jié)果顯示抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl2的表達(dá)隨葛根素濃度增高而減低，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果保持了一致性。此外，隨著葛根素濃度的增高，細(xì)胞外IL-6表達(dá)水平顯著降低，同時(shí)p-STAT3/STAT3蛋白比值逐漸降低，這表明葛根素可抑制細(xì)胞外IL-6的分泌以及STAT3的磷酸化，即可通過(guò)抑制IL-6/STAT3通路起到治療腫瘤的作用。

綜上所述，葛根素對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞具有顯著抑制作用，具體表現(xiàn)為促進(jìn)凋亡以及抑制增殖，抑制IL-6/STAT3通路可能是其關(guān)鍵作用機(jī)制。因此，作為一種低毒、安全有效的傳統(tǒng)藥物，葛根素在治療宮頸癌方面具有極大潛力。