葉德曉，李慧靈，林育成，鄧誠，陳宏基，周金林*

（1.廣東金駿康生物技術(shù)有限公司，廣東佛山 528225；2.佛山匯騰生物技術(shù)有限公司，廣東佛山 528225）

α-L-鼠李糖苷酶（EC 3.2.1.40）是一類糖苷水解酶，主要屬于GH13、GH28、GH78和GH106家族，能高效水解許多天然糖苷酶類化合物末端的鼠李糖基，如水解橙皮苷、柚皮苷、蘆丁和槲皮苷等天然黃酮類糖苷化合物為橙皮素單葡萄糖苷、普魯寧、異槲皮苷和槲皮素等。α-L-鼠李糖苷酶能應(yīng)用于食品業(yè)中柑桔類果汁的去苦、飲料風(fēng)味改善以及食品添加劑的生產(chǎn)等[1]。除了在食品領(lǐng)域的應(yīng)用，α-L-鼠李糖苷酶還能應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，如用于生產(chǎn)藥物或者藥物中間體以及對藥物進行改性以提高藥效等[2]。

橙皮苷在柑桔屬的果皮中含量豐富，而我國是柑桔屬果樹種植和產(chǎn)量的第一大國，因此提高其綜合利用率對增加產(chǎn)業(yè)附加值具有重大意義。橙皮苷溶解性極低，人體較難吸收，生物利用率低，表現(xiàn)出相對較弱的藥理作用。研究表明，黃酮類化合物脫掉部分糖苷或者全部糖苷后，能被小腸更好地地吸收，以此來提高黃酮類化合物在人體的生物利用率[3]。利用α-L-鼠李糖苷酶將橙皮苷水解為橙皮素單葡萄糖苷，改善其溶解性，提高其生物利用率，可以加大其在食品和醫(yī)藥行業(yè)的運用范圍；另外，橙皮素單葡萄糖苷在鼠李糖轉(zhuǎn)移酶的催化下生成新橙皮苷，新橙皮苷是合成天然甜味劑NHDC的關(guān)鍵中間體，在酸橙中含量低，提取工藝復(fù)雜，成本高。因此，選用低成本的橙皮苷通過α-L-鼠李糖苷酶和鼠李糖轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化得到新橙皮苷在合成NHDC的產(chǎn)業(yè)化上有重大價值。

將來源于T.petrophila的TpdRha基因進行分子克隆和異源表達，探究其水解橙皮苷為橙皮素單葡萄糖苷的活性，為后續(xù)研究酶轉(zhuǎn)化新橙皮苷及NHDC奠定物質(zhì)基礎(chǔ)，能產(chǎn)生較好的社會價值。

1 材料與方法

1.1 材料

克隆宿主大腸桿菌Top10、表達宿主畢赤酵母GS115和畢赤酵母KM71H、表達載體pPIC9K均為實驗室保存。實驗所用酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、山梨醇、瓊脂粉、瓊脂糖、磷酸氫二鈉和檸檬酸鈉等試劑均為分析純，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；BIO-RAD MicroPulser 1652100型電轉(zhuǎn)儀，購自美國BIO-RAD公司；Agilent 1100型高效液相色譜，購自安捷倫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 TpdRha序列分析

由CAZy數(shù)據(jù)庫，獲知6個已鑒定3D結(jié)構(gòu)α-L-鼠李糖苷酶。在NCBI中獲知其氨基酸序列，利用Clustalx軟件進行氨基酸多重序列比對，再通過ESPript 3.0對比對結(jié)果進行渲染，最后用MEGA7軟件制作分子進化樹。

1.2.2 TpdRha基因克隆

根據(jù)TpdRha在NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的序列信息，利用密碼子偏好性進行優(yōu)化，依據(jù)優(yōu)化結(jié)果進行合成，將其克隆至pPIC9K載體上。提取質(zhì)粒pPIC9K-TpdRha，以質(zhì)粒為模板，通用引物AOX進行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，交由生工生物有限公司測序。

1.2.3 異源表達

利用SalⅠ酶線性化pPIC9K-TpdRha質(zhì)粒，回收后將其電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115和畢赤酵母KM71H中。經(jīng)過含G418的YPD培養(yǎng)基篩選，挑選單克隆裂解后以通用引物AOX進行PCR鑒定，將正確的陽性克隆命名為GS115-TpdRha和KM71H-TpdRha。

接種菌株到Y(jié)PD培養(yǎng)基于30 ℃活化培養(yǎng)，1%的接種量至BMGY培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)OD600到2～6。室溫離心，收集菌體，用BMMY重懸菌體，28 ℃誘導(dǎo)表達，每天加終濃度為0.5%的甲醇，維持誘導(dǎo)條件。誘導(dǎo)表達5 d，4 ℃離心，上清即為粗酶液。

1.2.4 TpdRha酶解橙皮苷

分別加入pH為4.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、橙皮苷混勻，加入粗酶液到混合后的橙皮苷溶液中，60 ℃恒溫反應(yīng)4 h，加入等體積的乙酸乙酯抽提，取上層有機相，經(jīng)真空濃縮后，反應(yīng)產(chǎn)物溶解于甲醇中，結(jié)果用HPLC檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

檢索CAZy數(shù)據(jù)庫，TpdRha屬于GH78家族，具有876個氨基酸殘基和糖基化位點，無信號肽序列，包含4個超家族保守結(jié)構(gòu)域，其中Bac_rhamnosid_N可能與識別底物有關(guān)，另3個保守結(jié)構(gòu)域與其生物活性相關(guān)。TpdRha與DtRha（ACI19983.1）序列同源性為46.25%；與SaRha78A（BAC68538.1）序列同源性為35.64%；與AtRha（AFH54529.1）序列同源性為31.86%；與RhaB（BAB62315.1）序列同源性為27.78%；與KoRha（AEX05711.1）序列同源性為24.52%；與BtRha（AAO76108.1）序列同源性為20.76%。多重序列比對結(jié)果顯示Asp456、Trp466、Gly468、Asp469、Asp572、Trp573、Trp745、Glu746、Ser758和His761的氨基酸殘基高度保守，其中Asp456、Glu462、Asp469和Glu746在底物結(jié)合方面和生物催化活性上起到重要作用[4-5]。圖1的系統(tǒng)發(fā)育進化樹表明，TpdRha和DtRha進化關(guān)系相近，屬于一個進化分支，研究報導(dǎo)DtRha具有水解橙皮苷為橙皮素單葡萄糖苷的活性[6]，為研究TpdRha的水解橙皮苷的活性提供了進化理論基礎(chǔ)。

圖1 TpdRha系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.2 TpdRha基因克隆

將TpdRha克隆至pPIC9K載體上。圖2A是使用AOX引物進行菌液PCR鑒定的結(jié)果，可以得到約2 800 bp大小的片段，測序正確。對構(gòu)建成功的重組菌命名為Top10-pPIC9K-TpdRha，保留菌種，培養(yǎng)，提取質(zhì)粒（圖2B）。

圖2 pPIC9K-TpdRha克隆及質(zhì)粒提取

2.3 構(gòu)建pPIC9K-TpdRha重組表達畢赤酵母菌

線性化pPIC9K-TpdRha質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115和KM71H中，得到的重組表達菌株分別命名為GS115-TpdRha和KM71H-TpdRha。挑選單菌落通用引物AOX進行菌落PCR鑒定。

圖3為重組畢赤酵母菌液PCR鑒定結(jié)果。圖3A結(jié)果顯示GS115-TpdRha陽性菌株在2 200 bp出現(xiàn)AOX條帶以及在2 800 bp左右出現(xiàn)目的基因條帶，由于TpdRha基因大小為2 600 bp，當(dāng)重組載體整合于GS115基因組后，TpdRha基因與pPIC9K兩端序列同源臂結(jié)合，在PCR擴增時，目的基因?qū)⒆兂? 800 bp的片段。結(jié)果表明，TpdRha基因?qū)崿F(xiàn)與畢赤酵母GS115基因組成功整合。

圖3B結(jié)果顯示KM71H-TpdRha陽性菌株只在2 800 bp左右出現(xiàn)目的基因條帶，由于TpdRha基因大小約為2 600 bp，當(dāng)重組載體整合于KM71H基因組后，TpdRha基因與pPIC9K兩端序列同源臂結(jié)合，在PCR擴增時目的基因?qū)⒆兂? 800 bp的片段，而KM71H細胞本身不具有AOX基因，因此只出現(xiàn)一條條帶。結(jié)果表明，TpdRha基因?qū)崿F(xiàn)與畢赤酵母KM71H基因組成功整合。

圖3 pPIC9K-TpdRha重組畢赤酵母鑒定

2.4 TpdRha酶轉(zhuǎn)橙皮苷應(yīng)用

重組表達菌株GS115-TpdRha和KM71HTpdRha經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達后，分離得到粗酶液。以橙皮苷為底物進行反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物用HPLC進行檢測。圖4檢測結(jié)果顯示，GS115-TpdRha和KM71HTpdRha異源表達得到的粗酶液均對橙皮苷有水解活性，轉(zhuǎn)化率分別為25.38%和36.64%，KM71HTpdRha表達得到的酶活相對更強。兩種不同宿主表達出來的活性存在差異，推測與TpdRha在宿主的糖基化或表達量有關(guān)，其次與分泌表達后的降解率相關(guān)。對二者表現(xiàn)出的酶活差異，后續(xù)相關(guān)研究將采用KM71H-TpdRha重組菌進行優(yōu)化發(fā)酵生產(chǎn)TpdRha，為其進一步應(yīng)用于以橙皮苷為底物生產(chǎn)橙皮素單葡萄糖苷奠定基礎(chǔ)。

圖4 TpdRha異源表達活性檢測

3 結(jié)論

α-L-鼠李糖苷酶在天然產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化應(yīng)用中具有重大價值，從不同水平對其進行研究，可以為其在食品醫(yī)藥行業(yè)上的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。以可耐熱生長的T.petrophila的α-L-鼠李糖苷酶為目標(biāo)，對其氨基酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)其含有876個氨基酸殘基，無信號肽序列，有糖基化位點和4個保守超家族結(jié)構(gòu)域。序列比對顯示TpdRha與DtRha同源性較高，為46.25%；多重序列比對結(jié)果顯示TpdRha有10個氨基酸殘基位點高度保守；經(jīng)3D結(jié)構(gòu)分析推測Asp456、Glu462、Asp469和Glu746在底物結(jié)合方面與生物催化活性上起重要作用；系統(tǒng)發(fā)育進化樹結(jié)果顯示TpdRha與DtRha屬于同一個進化分支。