夏春，李寒雪，孫覓，曹明鋒，劉園，劉歡，雷曉，何佶弦，景延秋，程玉淵，楊益芬6

(1.中國煙草總公司四川省公司，四川 成都 610000；2.河南中煙工業(yè)有限責任公司，河南 鄭州 450002；3.湖南省煙草公司常德市公司，湖南 常德 415000；4.河南省煙草公司南陽市公司，河南 南陽 473000；5.河南農業(yè)大學煙草學院，河南 鄭州450002；6.成都海關技術中心，四川 成都 610041)

朱尊權[1]、于華堂等[2]的研究表明，煙葉成熟度、葉片結構與細胞形態(tài)特征具有密切關系，細胞的大小和排列方式決定了葉片結構的疏密程度，不同成熟度煙葉的葉片結構疏密程度不同。時向東等[3]研究了烤煙葉片生長發(fā)育過程中細胞超微結構變化，結果表明，隨著葉長的增加，柵欄細胞的體積逐漸增大，葉綠體結構逐漸完善，淀粉粒和嗜鋨顆粒體積逐漸增大，煙葉適熟采收時，葉綠體數量減少，淀粉粒和嗜鋨顆粒充實細胞內部，煙葉產量和質量達到最佳；而嗜鋨物質與淀粉粒不僅與烤煙香氣質量具有一定聯系[4]，還可能與煙葉葉綠體代謝、煙葉風格的形成有關?；娜A等[5]對比分析了河南與云南烤煙生長發(fā)育過程中葉片超微結構的差異，認為兩地煙葉在生長發(fā)育過程中葉片超微結構的變化規(guī)律相似；生育前期葉綠體內淀粉粒和嗜鋨顆粒較少；生育中期表現為淀粉粒較多、嗜鋨顆粒較少；生育后期葉綠體降解速度較慢，嗜鋨顆粒較少。云南煙葉生育期較長，葉綠體代謝較活躍，這可能是云南煙葉風格為清香型的形成原因之一。過偉民等[6–8]通過對烤后煙葉進行掃描電鏡觀察，已初步建立細胞形態(tài)特征指標的量化方法，探討不同產地、不同部位間煙葉表面微觀形態(tài)特征的相似性和差異性，并試圖建立烤煙葉片微觀結構與物理、外觀品質間的關系模型。筆者對不同部位烤煙葉片超微結構進行量化處理，探討烤煙不同部位間葉片超微結構的差異，采用典型相關分析方法，分析超微結構指標與烤煙常規(guī)化學成分含量的關系，旨在明確與烤煙品質指標相關的細胞指標，為從微觀角度改善烤煙化學品質提供新的研究途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

以河南登封市大金店、石道、穎陽和君召鎮(zhèn) 4個植煙區(qū)種植的豫煙6號品種為材料，于適熟期取下部(葉位 5～7)、中部(葉位 8～12)和上部(13～18)鮮煙葉用于透射電子顯微鏡觀察；采摘后統(tǒng)一標記編桿入烤房烘烤。

1.2 方法

1.2.1 煙葉超微結構觀察及指標的量化

在烤煙葉片主脈中部附近切取2 mm×2 mm材料，參照文獻[5]的方法進行固定，于透射電子顯微鏡(JEM–1400日本)下觀察全細胞、細胞核、葉綠體、線粒體等結構并拍照。采用 Adobe Photoshop CC 2015軟件，基于像素比值法[9–12]，對每個圖像中細胞面積(X1)、細胞周長(X2)、細胞因子(X3)、液泡面積(X4)、液泡面積與細胞面積比值(X5)、細胞壁厚度(X6)等指標進行量化。

1.2.2 烤煙化學常規(guī)成分含量的測定

剔除有明顯病斑或因烘烤因素造成糟片、掛灰的烤煙，送交河南省鄭州市黃金葉技術指導中心，按葉位測定煙葉常規(guī)化學成分蛋白質(Y1)、鉀(Y2)、氯(Y3)、還原糖(Y4)、總糖(Y5)、煙堿(Y6)、總氮(Y7)含量。

1.3 數據處理

采用SPSS l8.0軟件對數據進行方差分析、簡單相關分析和典型相關分析。

2 結果與分析

2.1 烤煙不同葉位葉片超微結構的差異

觀察烤煙葉片超微結構，中、下部葉細胞與上部葉對比略偏橢圓，排列與上部葉相似(圖1–1、2、3)；葉片表面細胞輪廓清晰(圖1–4、5、6)，細胞壁內部均明顯有細胞核、葉綠體、線粒體等貼壁分布，中央液泡填充細胞中部(圖1–4、5、6)；上部葉細胞呈圓形且排列緊密、整齊(圖1–1、4、7)；葉肉細胞細胞核染色質凝聚隨葉位升高而有所加劇(圖1–7、8、9)，葉綠體外膜和類囊體片層均出現降解現象，葉綠體外觀模糊，類囊體結構松散，葉綠體周圍均有少數線粒體分布，且其內部均含有清晰的淀粉粒和嗜鋨顆粒(圖1–10、11、12)，葉肉細胞內器官狀態(tài)隨著葉位升高而更好，淀粉粒和嗜鋨顆粒含量也隨著葉位升高而升高。葉肉細胞電鏡圖像量化結果表明，液泡面積與細胞面積的比值從大到小依次為下部葉、中部葉、上部葉，說明隨著葉位的上升，葉肉細胞細胞器、淀粉粒、嗜鋨顆粒等物質越豐富。

圖1 烤煙不同葉位葉片的超微結構Fig.1 Ultrastructural morphology of leaves in different leaf positions of flue-cured tobacco

采用最小顯著差異法，對不同葉位烤煙葉片細胞超微結構量化指標進行方差分析和多重比較，結果(表1)表明，上部葉細胞面積最大，下部葉周長最大，中部葉細胞面積、周長最小，且上部葉細胞面積極顯著大于中部葉，細胞周長極顯著大于中部葉；細胞因子變化很小，且均接近 1，形狀相對規(guī)則；下部葉液泡面積最大，中部葉液泡面積最小，且下部葉液泡面積極顯著大于中部葉；下部葉液泡面積與細胞面積的比值最大，上部葉最小，且下部葉極顯著大于上部葉；下部葉細胞壁厚度最大，中部葉細胞壁厚度最小，且下部葉細胞壁厚度極顯著大于上、中部葉。

表1 烤煙不同部位葉片超微結構指標的量化結果Table 1 Quantitative results of ultrastructural indexes of flue-cured tobacco leaves in different parts

2.2 不同部位煙葉的常規(guī)化學成分的差異

不同部位煙葉的常規(guī)化學成分含量及多重比較結果如表2所示。下部葉蛋白質、鉀、氯含量極顯著高于中部葉和上部葉，中部葉與上部葉的差異無統(tǒng)計學意義；上部葉煙堿、總氮含量極顯著高于中部葉和上部葉，中部葉與上部葉的差異無統(tǒng)計學意義；中部葉還原糖含量極顯著高于下部葉和上部葉，下部葉和上部葉的差異無統(tǒng)計學意義；上部葉與中部葉總糖含量極顯著大于下部葉，上部葉與中部葉之間的差異無統(tǒng)計學意義。綜上，上部葉煙堿和總氮含量較高，鉀含量較低；中部葉還原糖和總糖含量較高，蛋白質、氯、總氮含量較低；下部葉蛋白質、鉀和氯含量較高，還原糖、總糖和煙堿含量最低。

表2 不同部位煙葉的常規(guī)化學成分含量Table 2 Conventional chemical composition indexes in different parts of flue-cured tobacco %

2.3 描述性統(tǒng)計分析

對細胞結構量化結果和烤煙常規(guī)化學成分指標進行描述性統(tǒng)計分析，結果(表3)表明，細胞指標變異系數大小依次是細胞因子、細胞壁厚度、液泡面積和細胞面積、細胞周長、液泡面積/細胞面積；烤煙常規(guī)化學成分指標變異系數大小依次是氯、鉀、煙堿、總氮、蛋白質、還原糖、總糖。除烤煙指標總糖偏度系數小于 0，為左偏峰外，細胞指標以及其余烤煙指標均大于 0，為右偏峰，其細胞指標中細胞因子和細胞壁厚度與烤煙指標中鉀和氯的偏度系數較大，正向偏態(tài)較明顯；細胞指標中，細胞面積、細胞周長與液泡面積/細胞面積的峰度系數小于 0，為平闊峰，數據較為分散，剩余指標峰度系數大于 0，為削尖峰，數據較為集中。綜上，細胞指標和烤煙各指標均呈正態(tài)分布，表明數據穩(wěn)定性較好，具有較好的統(tǒng)計學意義。

表3 煙葉細胞微觀結構量化結果與常規(guī)化學成分描述性統(tǒng)計Table 3 Quantitative results of cell microstructure and descriptive statistical analysis of conventional chemical components

2.4 烤煙葉片超微結構指標與常規(guī)化學成分的典型相關分析

將烤煙葉片細胞量化指標細胞面積、細胞周長、細胞因子、液泡面積、液泡面積/細胞面積、細胞壁厚度作為第1組變量，烤煙常規(guī)化學成分指標蛋白質、鉀、氯、還原糖、總糖、煙堿與總氮作為第2組變量進行典型相關分析，結果列于表4。典型變量Ⅰ和典型變量Ⅱ均達到極顯著相關水平，相關系數λ分別為0.692和0.630；典型變量Ⅲ和典型變量Ⅳ均達到了顯著相關水平，相關系數λ分別為0.379和0.320，后2組的典型相關系數則不顯著，因此選擇典型變量Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ進行分析。

表4 煙葉細胞微觀結構量化結果與常規(guī)化學成分指標的典型相關Table 4 Typical correlation analysis between quantitative results of cell microstructure and conventional chemical composition indexes

典型變量Ⅰ分析結果表明，細胞壁厚度與蛋白質和氯存在較高的負相關，說明隨著細胞壁厚度的增加，烤煙中蛋白質和氯含量呈增加趨勢，總糖呈降低趨勢。典型變量Ⅱ分析結果表明，細胞面積、細胞周長、細胞因子、煙堿與總氮存在較高正相關，說明隨著細胞面積、細胞周長、細胞因子的增大，烤煙中煙堿和總氮含量呈增加趨勢。典型變量Ⅲ分析結果表明，細胞面積和液泡面積與還原糖含量存在較高的負相關，說明隨著細胞面積、液泡面積的增大，烤煙中還原糖含量呈降低趨勢。典型變量Ⅳ分析結果表明，細胞因子和液泡面積/細胞面積與蛋白質含量存在較高的負相關，說明隨著細胞因子、液泡面積與細胞面積的比值升高，烤煙中蛋白質含量呈降低趨勢。典型變量Ⅴ、Ⅵ相關系數與顯著性水平普遍較低，因此可以認為細胞指標與烤煙常規(guī)化學成分指標間沒有明顯相關性。

3 結論與討論

運用Adobe Photoshop CC 2015軟件，采用像素比值法對烤煙不同葉位間葉片超微結構進行指標量化。細胞壁決定細胞形狀，其主要成分是果膠和纖維素[13–14]，因而影響烤煙的形態(tài)結構。烘烤過程中細胞壁物質降解并轉化為低糖和單糖物質，煙葉組織結構和細胞骨架結構被破壞，表現為烤煙葉片形態(tài)收縮扭曲[15–16]。本試驗結果表明，烤煙不同葉位間細胞壁厚度差異顯著，細胞壁厚度與蛋白質和氯含量呈較高正相關，與總糖含量呈負相關。細胞壁越厚，其細胞壁物質含量越高，但對烤煙香氣質和香氣量越不利，使烤煙雜氣增加[17–18]。細胞壁越厚，烤煙的蛋白質、氯含量越高，會使煙葉燃燒性不良，吃味差，刺激性大，品質下降。

上部葉細胞面積極顯著大于中部葉，身份適中與身份較薄的烤煙對比，前者細胞面積較后者大[7]，所以烤煙上部葉身份普遍較中部葉厚；下部葉和上部葉的細胞周長顯著大于中部葉，細胞周長與葉片厚度呈極顯著負相關[8]，所以下部葉和上部葉厚度小于中部葉，這與葉片厚度隨著葉位的升高而增加有出入，可能是由于烤煙葉片厚度還和細胞排列方式有關[8]所致。細胞指標與烤煙常規(guī)化學成分指標典型相關分析結果表明，細胞面積、周長與烤煙煙堿和總氮含量呈正相關。細胞面積和周長的值越大，其身份越厚；厚度越大，煙堿、總氮與蛋白質含量隨著烤煙葉片厚度變大、身份增厚而變大[19]；細胞因子越大，細胞偏離圓形程度越大，烤煙葉片厚度越小，身份越薄[8]。根據這些分析推斷，蛋白質、煙堿、總氮含量越高，細胞形狀因子應該越小。本試驗結果表明，細胞形狀因子與蛋白質含量呈負相關關系，這與上述結果一致；細胞形狀因子與總氮和煙堿含量呈正相關，這可能是因為烤煙總氮和煙堿含量不僅與烤煙細胞排列和烤煙葉片物理性狀有關系，還與其細胞中其他內含物有關[20]。

從烤煙葉片超微結構圖像中可以看出，單個細胞內葉綠體、線粒體、淀粉粒與嗜鋨物質貼壁排布，細胞中間由中央大液泡填充。煙葉品質成分中大部分或者全部糖類物質在葉綠體中合成后，一部分儲存于葉綠體中，另一部分儲存于液泡當中[21]。本研究結果表明，細胞中液泡面積越大，葉綠體等細胞器含量越少，煙葉品質成分中糖類物質合成越少，因而液泡面積與細胞面積的比值與烤煙還原糖含量呈負相關。此外，隨著液泡面積與細胞面積比值的增加，烤煙蛋白質含量降低，可能是因為液泡面積占細胞面積比值越大，細胞中葉綠體、淀粉粒和嗜鋨物質含量越少，淀粉粒和嗜鋨物質積累量不足，造成煙葉調制過程中生理生化反應不充分，加大了調制難度所致。在分析烤煙葉片葉綠體、淀粉粒、嗜鋨物質和液泡各自面積大小對烤煙常規(guī)化學成分影響情況時，需考慮細胞面積指標，需進一步加大研究建立細胞器面積與細胞面積的比值與烤煙品質指標間的數學模型。