黃雄，郭英華，田林，李全梓，岳志強(qiáng)

(中國林業(yè)科學(xué)研究院林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091)

基因組大小的測定不僅對物種的分子遺傳與細(xì)胞遺傳研究具有重要意義，也為其基因組學(xué)及其親緣進(jìn)化研究以及生態(tài)學(xué)研究提供重要參考[1]。目前，測定基因組大小的方法有孚耳根微顯影法、基因組測序法和流式細(xì)胞術(shù)[2–4]。流式細(xì)胞術(shù)是一種對懸浮于流體中的微小顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)和分選的生物學(xué)計(jì)數(shù)方法，具有操作簡單、分析速度快、結(jié)果相對準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于物種基因組大小的測定[5–7]、核型分析[8]和細(xì)胞計(jì)數(shù)[9]等方面的研究。

桫欏(Alsophila spinulosa)是孑遺植物，屬桫欏科(Cyatheaceae)桫欏屬(Alsophila)，別名樹蕨、蛇木等，是現(xiàn)存唯一的木本蕨類植物，株高可達(dá)數(shù)米，有“蕨類植物之王”的美譽(yù)[10–11]，目前處于瀕臨滅絕狀態(tài)，被列為國家一級野生保護(hù)植物[12–13]。桫欏的生長對環(huán)境的要求較高，喜陰冷潮濕，在中國僅分布于南方和西南地區(qū)[14]。桫欏的莖干有較好的藥用價(jià)值，具有潤肺止咳、除濕祛風(fēng)等功效，被稱為“龍骨風(fēng)”。目前，對桫欏化合物成分[15–16]、配子體和孢子體[17]、染色體數(shù)目與核型[18]、栽培技術(shù)[19]等方面進(jìn)行了較多研究，但有關(guān)桫欏基因組大小的研究尚少見報(bào)道。本試驗(yàn)中，以買麻藤為內(nèi)參，采用流式細(xì)胞儀對桫欏的基因組大小進(jìn)行分析，旨在為今后開展桫欏屬植物基因組學(xué)的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

桫欏采自四川省洪雅縣桫欏國家種質(zhì)資源庫(N29°52′，E103°11′)；買麻藤由中國林業(yè)科學(xué)研究院林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：流式細(xì)胞儀(BD Influx)、熒光顯微鏡(Carl Zeiss)、離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific)。

裂解液：Tris·MgCl2[20]、LB01[21]、WPB[22]、Otto’s[23]、Galbraith’s[24]，配方詳見表1。

表1 5種細(xì)胞核裂解液的配方Table 1 Component of five nuclear lysis buffers

供試試劑：碘化丙啶(propidiumiodide，PI)染液、PBS溶液、鞘液。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞核懸液的制備

在預(yù)冷的培養(yǎng)皿中加入1 mL預(yù)冷的裂解液，放入約0.2 g桫欏和0.1 g買麻藤幼嫩葉片，用刀片切碎后，再加入1 mL預(yù)冷的裂解液，使材料全部浸沒在裂解液中。裂解5 min后，用1 mL移液槍吸取培養(yǎng)皿內(nèi)的裂解液，過篩(孔徑為 48 μm)至 2 mL離心管中，離心(3 000 r/min)8 min。棄上清液后，將細(xì)胞核沉淀置于 4 ℃冰箱保存，備用。每種裂解液各做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 DNA特異性染色

向細(xì)胞核沉淀中加入 500 μL預(yù)冷的碘化丙啶(PI)染料，用移液槍將聚集成團(tuán)的細(xì)胞核分開，置于4 ℃冰箱中，避光染色15 min。

染色后，離心(3 000 r/min)4 min，棄上清液，再加入 30 μL預(yù)冷的 1%PBS溶液，重懸沉淀后，用移液槍吸取10 μL核懸液于載玻片上，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核染色情況。

1.3.3 流式細(xì)胞儀檢測

將染色后的細(xì)胞核沉淀移至上樣管，加入500 μL鞘液，充分混勻后上機(jī)檢測。采用波長為488 nm的激光，收集610/20通道的熒光，檢測PI的發(fā)射熒光強(qiáng)度。每個(gè)樣品至少收集 2萬個(gè)細(xì)胞核(不包括碎片)。測定所得的數(shù)據(jù)由儀器自帶的BD FACS軟件進(jìn)行處理分析，計(jì)算細(xì)胞核 DNA的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 裂解液的篩選結(jié)果

用 5種裂解液處理桫欏幼嫩葉片后，發(fā)現(xiàn)葉片顏色變化有所差異。用WPB、LB01裂解的葉片呈綠色，用 Tris·MgCl2、Otto’s、Galbraith’s裂解的葉片呈褐色或深褐色。在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn) WPB和 LB01的裂解效果較好，能很好地將細(xì)胞核游離出來，細(xì)胞核的數(shù)量較多，背景雜質(zhì)和碎片較少；Tris·MgCl2、Otto’s、Galbraith’s 裂解出的細(xì)胞核數(shù)量較少，呈零星分布，大部分為背景雜質(zhì)和碎片(圖1)。LB01裂解液中含有 β–巰基乙醇[25]，是一種有毒物質(zhì)，對人體有害。綜合來看，WPB為本研究篩選的最佳裂解液。

圖1 細(xì)胞核的染色熒光檢測結(jié)果Fig.1 Nucleus fluorescence detection after staining

2.2 基因組大小的測定

對比分析待測樣品桫欏與買麻藤單獨(dú)測定的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)桫欏測定峰的位置和買麻藤的沒有重疊干擾，也沒有在買麻藤測定峰 1/2或 2倍的位置，排除了2個(gè)物種2C DNA和4C DNA峰的交叉影響，保證了用買麻藤作內(nèi)參的準(zhǔn)確性(圖2)。

圖2 流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果Fig.2 The peak graph of FCM detection

采用 BD FACS軟件對桫欏和買麻藤混合樣品進(jìn)行流式結(jié)果分析。從分析結(jié)果(圖3)可以看出，桫欏和買麻藤的熒光峰圖能較好地分開，曲線平滑，峰形較佳。根據(jù) 3次測定結(jié)果(表2)，可計(jì)算出桫欏的 2C DNA熒光峰值是買麻藤 2C DNA熒光峰值的1.475倍。根據(jù)買麻藤的基因組大小4.07 Gb[26]，計(jì)算得到桫欏基因組大小為6 003.25 Mb。

變異系數(shù)(CV值)是流式細(xì)胞術(shù)中檢驗(yàn)精準(zhǔn)度的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，CV值越小，說明細(xì)胞核完整性越好，碎片越少。從表2可以看出，所有測定結(jié)果中的變異系數(shù) CV值均控制在 4%以下，進(jìn)一步保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。

圖3 桫欏和買麻藤混合樣品流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果Fig.3 The peak graph of FCM detection for mixed samples

表2 桫欏和買麻藤混合樣品檢測熒光峰值Table 2 The FCM detection statistical results for mixed samples

3 結(jié)論與討論

在用流式細(xì)胞術(shù)測定物種基因組大小時(shí)，裂解液的篩選至關(guān)重要。本研究中，對 5種裂解液進(jìn)行綜合篩選，WPB裂解液能很好地裂解桫欏細(xì)胞，釋放出細(xì)胞核，且雜質(zhì)少，可降低不必要的干擾信號；LB01裂解液對桫欏也有較好的裂解效果，但 LB01裂解液中的 β–巰基乙醇對人體有害；綜合分析，WPB為本研究桫欏最佳裂解液。

研究[27–28]表明，所選取的參照植物與待測物種的基因組大小相差越大，誤差就越大，結(jié)果越不準(zhǔn)確。本研究以買麻藤作內(nèi)參，單獨(dú)對買麻藤和桫欏進(jìn)行測定時(shí)，兩者的熒光峰圖沒有重疊，區(qū)分度好，且二者峰圖相近，表明它們的基因組大小相近；同時(shí)，買麻藤基因組已被全基因組測序，其組裝質(zhì)量很好，充分保證了用買麻藤作內(nèi)參的可靠性。通過流式細(xì)胞儀檢測桫欏和買麻藤混合樣品細(xì)胞核 DNA，計(jì)算得到桫欏基因組大小為 6 003.25 Mb。桫欏基因組大小的測定可為今后開展桫欏屬植物基因組測序、文庫構(gòu)建和基因組學(xué)等相關(guān)研究提供參考。