王 浩，佟雪琪，朱明星，趙嘉慶，趙 巍

包蟲病是一種寄生蟲蚴蟲感染人體或家畜而引發(fā)的嚴重危害人畜健康的慢性感染性疾病。該病分布廣泛，世界范圍內(nèi)多個地區(qū)與國家均有流行。在我國，目前已經(jīng)證實有25個省區(qū)存在感染病例，尤其在西部等畜牧業(yè)發(fā)達地區(qū)，人群患病率為0.6%～4.5%[1]。寧夏是我國包蟲病發(fā)病最高的地區(qū)之一，有數(shù)據(jù)表明，寧夏川區(qū)和城市的陽性率分別達到了7.9%和5.8%，南部山區(qū)包蟲病血清陽性感染率為10.6%，B超篩查發(fā)現(xiàn)寧夏西吉縣中學生感染陽性率為2.1%[2]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度>200堿基的非編碼RNA。研究表明，lncRNA調(diào)控細胞多種生理過程，病理狀態(tài)下參與多種疾病包括腫瘤、感染、自身免疫病等的發(fā)生與發(fā)展，是當前的研究熱點[3-5]。本課題組前期研究表明，重組抗原p29作為潛在的疫苗在綿羊中展現(xiàn)出抗細粒棘球蚴感染的保護作用，具有作為包蟲病疫苗轉(zhuǎn)化應用的可能性[6]。然而lncRNA是否參與了p29的免疫保護作用尚不清楚。因此，本研究在小鼠腹腔繼發(fā)感染模型中，采用重組抗原p29免疫接種小鼠，收集血液中外周血單個核細胞(PBMCs)，提取總lncRNA并測序，經(jīng)高通量測序及生物信息學分析，尋找p29免疫保護過程中的lncRNA差異分子，為豐富p29疫苗預防包蟲病的分子機制提供基礎(chǔ)研究資料。

1 資料與方法

1.1 一般資料：45只BALB/c小鼠(雌性，8周齡，SPF 級)購自北京維通利華實驗動物有限公司，由寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心飼養(yǎng)。原頭蚴來源于寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院手術(shù)切除包蟲病患者的完整包囊。具體獲取步驟為：將手術(shù)剝離的包囊無菌轉(zhuǎn)移至實驗室，無菌抽取囊液，4 ℃ 9 000×g離心20 min。將沉淀用PBS緩沖液 (pH 7.2，含有 1 000 μg/mL 青霉素和1 000 U/mL 鏈霉素)調(diào)整濃度為200 μl PBS中含有1 500個原頭蚴。原頭蚴活性采用臺盼藍染色鑒定，以確?；钚?90%。

1.2 主要試劑：配制PBS緩沖液的干粉、青霉素、鏈霉素、臺盼藍、淋巴細胞分離液均采購于北京索萊寶生物有限公司。Magnetic Core試劑盒購自美國Epicentre公司。Trizol試劑購自美國Invitrogen公司。RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒均購自美國Thermo Fisher Scientific公司。引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.3 實驗動物分組：雌性6～8周齡BALB/c 小鼠[n=45，體重為(25±5) g]，隨機分為3組(15只/組)：空白對照組、感染組、p29+感染組，其中，空白對照組既不感染也不免疫。p29+感染組每只小鼠第1周背部皮下多點免疫接種10 μg重組抗原p29+等體積弗氏完全佐劑；第3周、第5周分別加強免疫接種10 μg重組抗原p29+等體積弗氏不完全佐劑各一次。在實驗第12周，感染組與p29+感染組每只小鼠腹腔注射(intraperitoneal，i.p.)1 500原頭蚴/200 μl PBS。在感染24周后，剖殺小鼠，采用高通量測序檢測各組外周血PBMC細胞中l(wèi)ncRNA分子的變化。

1.4 方法

1.4.1 提取小鼠外周血PBMCs:15 mL離心管中加入3 mL淋巴細胞分離液，隨后將抗凝管中血液樣本緩慢貼壁加入分離液上層，注意分層，4 ℃ 2 000×g 離心20 min；離心后，吸取中間白膜層到另一支新15 mL離心管，加入10 mL PBS緩沖液并混勻，4 ℃ 1 500×g 離心10 min；再用PBS緩沖液洗一遍，用于接下來的提取RNA。

1.4.2 提取總RNA并測序：將PBMCs細胞中加入1 mL Trizol試劑并混勻，室溫靜置10 min。隨后加入200 μl氯仿，迅速顛倒混勻15 s，室溫靜置5 min。4 ℃ 12 000×g 離心15 min，樣本分為3層，而RNA在上層水相中，故小心吸取上層水相至無RNA酶EP管，注意不要吸到有機相。隨后加入400 μl氯仿，4 ℃ 12 000×g 離心15 min。吸取上層水相液到新EP管，加入500 μl異丙醇(提前在-20 ℃冰箱內(nèi)預冷)，4 ℃ 14 000×g 離心30 min。棄上清液，加入500 μl 75%乙醇(用無RNA酶水配置，現(xiàn)用現(xiàn)配)混勻，離心后棄上清液。將含有RNA沉淀的EP管放在超凈工作臺中吹干，不能太干，否則不利于溶解。最后加入30 μl DEPC水，在OD 260/280 nm測定RNA濃度，并進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。隨后采用Magnetic Core試劑盒建立lncRNA文庫后，在中國科學院北京基因組研究所采用Illumina公司Hiseq 2 000高通量測序儀進行測序分析。

1.4.3 生物信息學分析獲得差異lncRNA：測序原始數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)量評估和前處理后，獲得高質(zhì)量reads，利用tophat 2軟件將高質(zhì)量reads比對到小鼠基因組上，并構(gòu)建轉(zhuǎn)錄本。全部reads用Cufflinks軟件正態(tài)分布化，獲得相互比較的表達數(shù)據(jù)，挑選出長度>200 nt，并且轉(zhuǎn)錄本與Hmmer/pfam比對沒有比對到已知domain的轉(zhuǎn)錄本作為最終的候選lncRNA，差異lncRNA用Cuffidiff軟件按照P<0.05且fold change>2的標準獲得。

1.4.4 qRT-PCR驗證：根據(jù)候選lncRNA序列，采用 primer 5.0軟件和同源性比較分析網(wǎng)站http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi設(shè)計引物并由上海生工公司合成。將之前提取的總RNA備份，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，隨后采用特異性引物PCR擴增。反應條件為：預變性95 ℃ 2 min，PCR反應變性95 ℃ 10 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；溶解曲線 95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃延伸，36個循環(huán)。以GAPDH(F：AGGTCGGTGTGAACGGATTTG;R：GGGGTCGTTGATGGCAACA)為內(nèi)參，每個差異分子分別做3個復孔，重復3次試驗。

2 結(jié)果

2.1 高通量測序及生物信息學分析獲得p29免疫后感染原頭蚴小鼠PBMCs中的差異lncRNA:通過二代高通量測序，所有reads每一個位置統(tǒng)計質(zhì)量均值的分布正常(圖1,目錄后)。進一步采用生物信息學分析測序數(shù)據(jù)，與感染組相比，p29+感染組PBMCs中共有30個顯著差異的lncRNA分子(P<0.05)，見表1-表2。

表1 空白對照組與p29+感染組的差異表達lncRNAs分子

表2 p29+感染組與感染組相比小鼠PBMCs中的差異表達lncRNAs

lncRNAlocus位置P值XLOC-016148 chr18:80571823-80606059 <0.05INTE-017619chr13:24501351-24510967 <0.05XLOC-010435chr14:25128119-25143354<0.05XLOC-002881 chr10:122117717-122135230 <0.05INTE-015204 chr12:99634636-99651115<0.05ANTI-047891chr3:60733771-61008987<0.05INTE-053834chr4:144871176-144928209 <0.05INTE-076608chr9:43991300-43995380<0.05INTE-047119 chr3:138925901-139076392 <0.05INTE-021333chr14:32076997-32080015<0.05INTE-055681chr5:92126629-92133689<0.05INTE-053354 chr4:129019384-129034617<0.05ANTI-018836 chr13:111882255-111884418 <0.05INTE-026966 chr15:74899119-74911337<0.05

2.2 qRT-PCR驗證p29免疫后感染原頭蚴小鼠PBMCs中的候選差異lncRNA：將上述測序獲得的30個lncRNA差異分子進行qRT-PCR驗證，與感染組相比，p29+感染組PBMC細胞中l(wèi)ncRNA分子XLOC-012763顯著降低(P<0.05)，INTE-015204顯著降低(P<0.05)，INTE-028446顯著降低(P<0.05)，見圖2(目錄后)。而這三個分子在空白組與感染組之間差異無統(tǒng)計學意義(圖2，目錄后)。經(jīng)生物信息學初步分析發(fā)現(xiàn)，XLOC-012763與 Dab2ip、Hc、Trem、Oas3基因可能相關(guān)，INTE-015204與klf4、Patz1、Cxxl2基因調(diào)控可能相關(guān)性，INTE-028446與klf4、Jchain基因可能有關(guān)聯(lián)性。

3 討論

包蟲病分為泡型和囊型兩種，在我國西部地區(qū)包括寧夏南部山區(qū)主要以囊型為主，故本研究采用了細粒棘球蚴感染小鼠模型開展研究。本研究前期證實，重組抗原p29疫苗免疫接種綿羊能夠獲得90%以上的保護力，表明該基因工程重組疫苗p29具有較好的抗包蟲感染效果[6]。進一步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)p29疫苗免疫后，抗包蟲特異性抗體IgE、IgG及其亞型IgG1、IgG2均顯著增加，Th1型細胞因子IL-2、IFN-γ顯著升高。這些結(jié)果提示p29免疫接種后，顯著激活了特異性體液免疫應答，同時有效活化了抗寄生蟲感染的Th1細胞，初步說明了p29保護作用的相關(guān)免疫機制[6-7]。然而，p29疫苗接種后如何激活免疫、產(chǎn)生保護力的確切細胞及其信號通路分子機制仍不清楚，故本研究團隊試圖從非編碼RNA調(diào)控免疫機制方面展開研究。就本研究而言，試圖尋找在p29免疫保護作用下感染原頭蚴小鼠PBMCs中l(wèi)ncRNA表達的變化。

LncRNA是一種長度>200 nt的非編碼RNA，在基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用[8]。隨著基因組計劃的完成，研究發(fā)現(xiàn)細菌的基因組編碼6 000個基因，線蟲的基因組編碼19 000個基因，果蠅的基因組編碼14 000個基因，而人的基因組也就只編碼20 000～25 000個基因，這表明高等生物的復雜性并不是由基因組所編碼的基因數(shù)目所決定的[9]。低等生物到高等生物基因數(shù)目相差不多，但是非編碼區(qū)域占比越來越高；人類基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物約98%是不編碼蛋白質(zhì)的RNA，表明高等生物的復雜性可能是由非編碼區(qū)域決定的[10]。與microRNA相比，lncRNA的調(diào)控作用形式更加復雜，這為lncRNA調(diào)控研究帶來了一定的難度[11]。但是，隨著高通量測序技術(shù)的不斷革新，lncRNA作為當前的研究熱點，已被證實在腫瘤、感染、自身免疫、慢性代謝性疾病等多種疾病中發(fā)揮重要作用。然而，lncRNA在寄生蟲感染中的作用與機制研究相對較少，且多數(shù)是原蟲類，如瘧原蟲感染中發(fā)現(xiàn)lncRNA分子發(fā)揮重要調(diào)控作用[12]。我們采用高通量測序，首次在p29免疫保護細粒棘球絳蟲感染中發(fā)現(xiàn)了30個lncRNA差異分子，隨后進一步通過qRT-PCR驗證獲得3個lncRNA候選分子?；趌ncRNA和mRNA的調(diào)控關(guān)系，其中，XLOC-012763與 Dab2ip、Hc、Trem、Oas 3基因可能相關(guān)，INTE-015204與klf4、Patz1、Cxxl2基因可能調(diào)控相關(guān)，INTE-028446與klf4、Jchain基因可能有關(guān)聯(lián)[13-15]。目前我們正在展開p29免疫轉(zhuǎn)錄組測序工作，這將為確定差異lncRNA分子的作用靶基因提供依據(jù)。此外，由于PBMC細胞是一群異質(zhì)性細胞，為了進一步尋找可能參與p29免疫保護的關(guān)鍵細胞，體外細胞實驗包括Th0細胞、Th1細胞、Th2細胞、DC等，將有助于找出上述lncRNA分子作用的免疫細胞。

近年，越來越多的研究證實，外周血液循環(huán)中l(wèi)ncRNA可能成為一些疾病潛在的生物標志物[16-17]。本研究中找到的外周血PBMC差異lncRNA分子亦有可能存在于外周血漿中，故檢測臨床包蟲病患者外周血漿中這些分子的表達情況，分析ROC曲線，將有助于評價其是否具有成為生物標志物的可能性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了p29免疫小鼠細粒棘球蚴感染中l(wèi)ncRNA存在顯著變化，證實了3個lncRNA差異分子，提示這些lncRNA差異分子可能參與了p29的疫苗保護作用，為p29疫苗的進一步的開發(fā)應用奠定了理論基礎(chǔ)。