曹 力，李格格，耿連欣，趙曉玲，鄭凱心

（河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023）

山茱萸（Cornus officinalisSieb.Et Zucc.）為山茱萸科植物的干燥成熟果肉，別名棗皮、山芋肉。主產(chǎn)于陜西、山西、河南等省，是我國(guó)傳統(tǒng)的滋補(bǔ)中藥材，具有補(bǔ)益肝腎、收澀固脫的功效[1]，用于治療眩暈耳鳴、腰酸遺精、崩漏帶下、大汗虛脫、內(nèi)熱消渴等病癥[2]。山茱萸果肉中含有環(huán)烯醚萜苷類、有機(jī)酸、鞣質(zhì)、多糖、酯類等多種化學(xué)成分[3-6]，具有代表性的功能活性成分為莫諾苷、馬錢苷、齊墩果酸和熊果酸等[7-8]。山茱萸果肉中還含有豐富的礦物質(zhì)元素、維生素A（vitamin A，VA）、維生素C（vitamin C，VC）及多種氨基酸成分[9-10]。現(xiàn)代藥理研究表明，山茱萸具有抗氧化、抗炎、降血糖、保護(hù)神經(jīng)及改善記憶等作用[11-12]。報(bào)道顯示，山茱萸多糖可改善大鼠的記憶、延緩衰老，扶植腸道的正常菌群的生長(zhǎng)，促進(jìn)腸道雙歧桿菌和乳桿菌的增殖，調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)[13]。山茱萸多糖及山茱萸中的有機(jī)酸和酯類有很好的抗氧化作用。山茱萸的活性成分莫諾苷在抗氧化應(yīng)激損傷、抑制Ca2+失衡和細(xì)胞凋亡方面具有重要的調(diào)節(jié)作用，這些作用與其降低胞內(nèi)乳酸脫氫酶的釋放，抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的蓄積，抑制細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度增加及細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白“Caspase-3”的表達(dá)有關(guān)[14]。以上研究成果提示，山茱萸在保健品和藥品領(lǐng)域的開發(fā)和應(yīng)用具有廣闊的前景。

山茱萸在我國(guó)被列入藥食同源目錄，故其是保健食品的重要原料來(lái)源。利用山茱萸果肉加工釀制而成的果酒，具有酒度低、風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)[10]。然而，由于生產(chǎn)原料本身及生產(chǎn)工藝等因素的影響，山茱萸果酒在貯藏過(guò)程中，易產(chǎn)生渾濁和沉淀，影響果酒的品質(zhì)。果酒的穩(wěn)定性較差，易出現(xiàn)渾濁沉淀。果酒沉淀的形成與酒中的微生物、大分子物質(zhì)和金屬離子有關(guān)[15]。果酒沉淀形成的機(jī)制較為復(fù)雜，根據(jù)酒體的特性選擇合適的澄清方式，是當(dāng)前消除沉淀的一種思路。果酒的澄清方法包括物理澄清法、化學(xué)澄清法及生物澄清法。物理澄清法有冷凍法和吸附法。化學(xué)沉淀法是利用澄清劑來(lái)達(dá)到澄清目的的一種方法，所選用的澄清劑有明膠、膨潤(rùn)土、殼聚糖和植物型澄清劑等。有研究者嘗試將不同澄清劑配合使用，達(dá)到了更好的澄清效果[16]。生物澄清法是利用酶制劑對(duì)果膠等物質(zhì)水解而使果酒澄清的一種方法。研究表明[17-18]，采用果膠酶澄清工藝對(duì)果汁能夠達(dá)到較好的澄清效果。本研究采用果膠酶對(duì)山茱萸果酒進(jìn)行澄清處理，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化澄清工藝，并以1,1-二苯基硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基（DPPH·）、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）自由基（ABTS+·）、羥基自由基（·OH）清除率分析其抗氧化活性，以期為山茱萸深加工利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

山茱萸果酒：本實(shí)驗(yàn)室自釀；果膠酶（酶活2萬(wàn)U/g）：上海藍(lán)季生物有限公司；DPPH、ABTS：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SKG A9打漿機(jī)：廣東艾詩(shī)凱奇智能科技有限公司；LAL2T型折光儀：廣州市速為電子科技有限公司；722分光光度計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司；PHS-2F pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；JA5003N電子天平：上海佑科儀器儀表有限公司；SPL-250恒溫培養(yǎng)箱：天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 山茱萸果酒的澄清

在山茱萸果酒中加入不同添加量的果膠酶，在不同的酶解溫度和時(shí)間條件下進(jìn)行果酒的澄清，取澄清液進(jìn)行澄清度檢測(cè)，以考察各因素對(duì)澄清效果的影響。

1.3.2 澄清度的檢測(cè)

采用分光光度法，以蒸餾水作為空白，在波長(zhǎng)550 nm處用1 cm比色杯測(cè)其透光率（%），用透光率表示果酒的澄清度。測(cè)定前，將處理后的果酒在3 500 r/min條件下離心10 min，取上層澄清液測(cè)其透光率。

1.3.3 澄清工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

果膠酶用量：取5份10 mL的山茱萸果酒置于試管中，分別按0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%的添加量將果膠酶添加于盛有果酒的試管中，充分混勻后，在40 ℃的恒溫水浴鍋中酶解120 min，然后測(cè)其透光率，分析果膠酶用量對(duì)山茱萸果酒澄清度的影響。

酶解溫度：取5份10 mL的山茱萸果酒置于試管中，加入0.04%的果膠酶，酶解時(shí)間120 min，分別在30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃的溫度條件下，進(jìn)行澄清試驗(yàn)，分析酶解溫度對(duì)山茱萸果酒澄清度的影響。

酶解時(shí)間：取5份10 mL的山茱萸果酒置于試管中，加入0.04%的果膠酶，分別固定酶解時(shí)間為30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，分析酶解時(shí)間對(duì)山茱萸果酒澄清度的影響。

1.3.4 澄清工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步優(yōu)化山茱萸果酒酶解澄清工藝條件。選擇變量因素果膠酶添加量（A）、酶解溫度（B）、酶解時(shí)間（C）作為變量因子，設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素編碼和水平見表1。

表1 澄清工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for clarification process optimization

1.3.5 山茱萸果酒感官指標(biāo)、理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)檢測(cè)

感官指標(biāo)：山茱萸果酒的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。參考相關(guān)報(bào)道方法[19]，從色澤、香氣、風(fēng)味和口感對(duì)山茱萸果酒進(jìn)行打分，取10位專家評(píng)分的平均值為最終分值，滿分100分。

表2 山茱萸果酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of dogwood fruitwine

理化指標(biāo)：山茱萸果酒的酒精度含量按照GB5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測(cè)度》中方法測(cè)定；基本指標(biāo)按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》規(guī)定的方法測(cè)定。

微生物指標(biāo)：菌落總數(shù)按照GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》規(guī)定方法進(jìn)行測(cè)定；大腸菌群按照GB 4789.3—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》規(guī)定方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 山茱萸果酒的抗氧化能力檢測(cè)

參照賀江等[20]報(bào)道的方法，檢測(cè)山茱萸果酒對(duì)DPPH·、ABTS+·及OH·的清除能力。

將DPPH配制成100 μmol/L的DPPH-乙醇工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。取100 μL的果酒樣加入離心管中，之后加500 μL DPPH-乙醇工作液，以蒸餾水代替酒樣設(shè)空白組，無(wú)水乙醇代替DPPH-乙醇工作液設(shè)對(duì)照組，以VC溶液為陽(yáng)性對(duì)照組，加DPPH-乙醇工作液后，充分混勻，避光靜置30 min。測(cè)定517 nm波長(zhǎng)條件下的吸光度值。每個(gè)樣品重復(fù)3次樣品DPPH·的清除率計(jì)算公式如下：

式中：A1為果酒樣組或VC組的吸光度值；A2為對(duì)照組吸光度值；A0為空白組吸光度值。

將5 mL ABTS（7 mmol/L）溶液與2.5 mL K2S2O8（7.35 mmol/L）混合后避光反應(yīng)12 h，取1 mL反應(yīng)液用0.2 mol/L的PBS稀釋，直至稀釋液在734 nm波長(zhǎng)處的吸光度值為0.7±0.03，制得ABTS工作液。取100 μL的果酒樣加入離心管中，之后加500 μL ABTS工作液，以蒸餾水代替酒樣設(shè)空白組，以蒸餾水代替ABTS工作液設(shè)對(duì)照組，以VC溶液為陽(yáng)性對(duì)照組，加ABTS工作液后，充分混勻，反應(yīng)10 min，測(cè)定734 nm波長(zhǎng)條件下的吸光度值。每個(gè)樣品重復(fù)3次。樣品ABTS+·的清除率計(jì)算公式如下：

式中：A1為果酒樣組或VC組的吸光度值；A2為對(duì)照組吸光度值；A0為空白組吸光度值。

取100 μL的果酒樣加入離心管中，與60 μL濃度為0.04 mol/L的H2O2混合后，再加入240 μL 0.1 mol/L pH7.2的磷酸鹽緩沖液，以蒸餾水代替酒樣設(shè)空白組，以蒸餾水代替H2O2設(shè)對(duì)照組，以VC溶液為陽(yáng)性對(duì)照組，加H2O2后，充分混勻，避光靜置10 min，測(cè)定230 nm波長(zhǎng)條件下的吸光度值。每個(gè)樣品重復(fù)3次。樣品OH·的清除率計(jì)算公式如下：

式中：A1為果酒樣組或VC組的吸光度值；A2為對(duì)照組吸光度值；A0為空白組吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠酶用量對(duì)山茱萸果酒澄清度的影響

不同果膠酶添加量對(duì)山茱萸果酒澄清效果的影響結(jié)果見圖1。

圖1 不同果膠酶添加量對(duì)果酒透光率的影響Fig.1 Effect of different pectinase addition on thetransmittance of fruit wine

由圖1可知，不添加果膠酶時(shí)，山茱萸果酒的透光率僅為72.9%。隨著果膠酶的添加量在0.01%～0.04%范圍內(nèi)的增大，果酒的透光率不斷升高。當(dāng)果膠酶的添加量＞0.04%時(shí)，果酒的透光率增加變緩。當(dāng)果膠酶的添加量＜0.04%時(shí)，由于果膠酶能與底物有效作用，加速了酶促反應(yīng)，使果酒的透光率增加迅速，當(dāng)酶的添加量＞0.04%時(shí)，酶促反應(yīng)速率降低，從而導(dǎo)致酶解效果不明顯[21]，則使果酒透光率增加緩慢。因此，選用果膠酶的最佳添加量為0.04%。

2.2 酶解溫度對(duì)山茱萸果酒澄清度的影響

不同酶解溫度對(duì)山茱萸果酒澄清度的影響結(jié)果見圖2。

圖2 不同酶解溫度對(duì)果酒透光率的影響Fig.2 Effect of different enzymatic temperature on the transmittance of fruit wine

由圖2可知，隨著酶解溫度在30～50 ℃范圍內(nèi)的升高，山茱萸果酒的透光率先升高后降低。酶解溫度低于40 ℃時(shí)，酶活力隨著溫度升高而增強(qiáng)，當(dāng)酶解溫度高于40 ℃之后，果膠酶的活性反而下降。由于酶是一種蛋白質(zhì)，隨著溫度進(jìn)一步升高，酶發(fā)生了變性，導(dǎo)致活性下降。在酶解溫度為40 ℃時(shí)，透光率最高。因此，選用最適酶解溫度為40 ℃。

2.3 酶解時(shí)間對(duì)山茱萸果酒澄清度的影響

不同酶解時(shí)間對(duì)山茱萸果酒澄清度的影響結(jié)果見圖3。

圖3 不同酶解時(shí)間對(duì)果酒透光率的影響Fig.3 Effect of different enzymatic time on the transmittance of fruit wine

由圖3可知，果酒的澄清度隨著酶解時(shí)間在30～150 min范圍內(nèi)的延長(zhǎng)而提高，在60～120 min的酶解過(guò)程中，果酒的透光率迅速升高，在120～150 min的酶解過(guò)程中，透光率增加幅度緩慢。這是由于當(dāng)酶解時(shí)間＜120 min時(shí)，酶解反應(yīng)較充分，透光率則呈不斷上升的趨勢(shì)；當(dāng)酶解時(shí)間＞120 min之后，底物基本分解完畢，酶解反應(yīng)也趨于結(jié)束，透光率增幅趨緩。因此，選取最佳酶解時(shí)間為120 min。

2.4 果膠酶澄清山茱萸果酒工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

澄清工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析見表4。由表3可知，以澄清度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，根據(jù)極差大小結(jié)果可知，各因素對(duì)山茱萸果酒澄清效果影響的次序?yàn)锽（酶解溫度）＞C（酶解時(shí)間）＞A（果膠酶添加量）。從表中的9次試驗(yàn)結(jié)果可以直接看出，A2B2C3的透光率最高，為91.6%，而由極差分析得出的最優(yōu)澄清效果方案為A2B2C2，對(duì)這一條件進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)定透光率為92.3%。因此，選取A2B2C2為最佳澄清工藝條件，即果膠酶添加量為0.04%，酶解溫度為40 ℃，酶解時(shí)間為120 min。由表4可知，酶解溫度、酶解時(shí)間和酶的添加量皆可顯著影響山茱萸果酒的澄清度（P＜0.05）。

表3 澄清工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for clarification process optimization

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results

2.5 山茱萸果酒的感官分值、理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)

在果膠酶最佳澄清工藝條件下，山茱萸果酒呈深紅色，有光澤，清亮透明；有典型的山茱萸果香；總體協(xié)調(diào)柔和，余味悠長(zhǎng)；入口柔軟平和，無(wú)尖澀和苦味，具有獨(dú)特風(fēng)格；山茱萸果酒的感官評(píng)分為94分。

山茱萸果酒的理化指標(biāo)如表5所示，所測(cè)理化指標(biāo)均達(dá)到相關(guān)國(guó)標(biāo)對(duì)果酒的要求。

表5 山茱萸果酒的理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果Table 5 Determination results of physicochemical indicators of dogwood wine

山茱萸果酒微生物指標(biāo)測(cè)定結(jié)果：菌落總數(shù)＜20 CFU/mL，大腸桿菌群＜3MPN/100mL，致病菌未檢出。其微生物指標(biāo)符合相關(guān)國(guó)標(biāo)要求。

2.6 山茱萸果酒的抗氧化活性

山茱萸果酒的抗氧化活性檢測(cè)結(jié)果見表6。由表6可知，其對(duì)DPPH·（清除率80.62%）、ABTS+·（清除率82.22%）及OH·（清除率85.07%）均有較好的清除能力。許多果實(shí)中因含有多酚類物質(zhì)而表現(xiàn)出抗氧化活性[22-23]，山茱萸中含有多酚類或環(huán)烯醚萜類物質(zhì)[24]，此兩類物質(zhì)成分具有一定的抗氧化活性，山茱萸中含量較大的成分馬錢苷和莫諾苷也具有抗氧化活性[25]，這些活性物質(zhì)可能在果酒發(fā)酵過(guò)程中得到很好的保留，所以使得果酒具有很好的抗氧化活性。另?yè)?jù)姚瑞祺等[19]報(bào)道，山茱萸果酒含有較高濃度的多酚類物質(zhì)，故其具有很好的抗氧化活性，能有效清除自由基。結(jié)果表明，山茱萸果酒具有一定的健康保健作用。

表6 山茱萸果酒的抗氧化活性結(jié)果分析Table 6 Results and analysis of antioxidant activity of dogwoodfruit wine

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用果膠酶研究了其山茱萸果酒的澄清效果，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，得出的最佳澄清工藝條件為果膠酶用量0.04%、酶解溫度40 ℃、酶解時(shí)間120 min，在此最佳酶解工藝條件下，果膠酶的澄清效果明顯，透光率達(dá)到92.3%，澄清效果明顯且感官評(píng)分較高。果膠酶的添加量、酶解溫度及酶解時(shí)間都對(duì)山茱萸果酒的澄清效果產(chǎn)生了顯著的影響，3種因素對(duì)澄清效果的影響順序?yàn)椋好附鉁囟龋久附鈺r(shí)間＞酶添加量?？寡趸钚栽囼?yàn)結(jié)果還顯示，山茱萸果酒（100 mL）對(duì)DPPH·、ABTS+·及OH·的清除率分別為80.62%、82.22%和85.07%，表明其具有較好的抗氧化能力和健康促進(jìn)作用。