李佩珊，張志歡，孫 雄,2，吳顯平，張永紅*，張 濤

(1.北京農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司，北京 100070)

細(xì)胞的原代培養(yǎng)具有廣泛的生物學(xué)意義，關(guān)鍵的一步便是獲得需要的原代細(xì)胞。酶消化是當(dāng)前獲得所需原代細(xì)胞最常用的方法，選擇對(duì)組織的解離效果好、損傷小的酶消化液，是獲得高活力細(xì)胞的重要環(huán)節(jié)。微血管內(nèi)皮細(xì)胞(microvascular endothelial cells，MVECs)因在機(jī)體多種生理過(guò)程和病理變化中起關(guān)鍵作用[1]，其體外培養(yǎng)模型越來(lái)越多的應(yīng)用于相關(guān)研究。肺MVECs由于傳代培養(yǎng)性能差，試驗(yàn)研究中需經(jīng)常進(jìn)行原代培養(yǎng)，早期組織塊貼壁法較為常用[2]，而近年來(lái)酶消化法的應(yīng)用日益增多，但所用的酶消化液種類(lèi)不盡相同，例如，0.25%胰蛋白酶-0.01% EDTA混合溶液[3]、膠原酶IV溶液[4]、0.2%膠原酶II溶液[5]、0.6%膠原酶P和2.1%分散酶[6]等。

雖然各種酶的消化活力有一定的組織特異性，但由于任一組織器官均不是由單一的組織細(xì)胞成分構(gòu)成，所以，酶消化液常需根據(jù)所分離培養(yǎng)細(xì)胞的種類(lèi)等因素進(jìn)行篩選。如前所述，不同文獻(xiàn)報(bào)道中對(duì)肺組織的消化選擇了不同的酶消化液，但當(dāng)前對(duì)各種酶消化液對(duì)肺MVECs分離培養(yǎng)效果的影響尚沒(méi)有系統(tǒng)的研究報(bào)道。為深入了解不同酶消化液對(duì)肺組織的消化效果，篩選更適合于體外分離培養(yǎng)肺MVECs的酶消化液，本試驗(yàn)根據(jù)各種酶的功能特點(diǎn)和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，選擇胰蛋白酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶、分散酶II和膠原酶II，分為單一酶消化液或兩種酶的混合消化液共9組，研究分析其對(duì)大乳鼠肺組織的消化效果，及消化分離的細(xì)胞在接種培養(yǎng)后的貼壁生長(zhǎng)情況，研究結(jié)果將為大乳鼠肺MVECs分離培養(yǎng)方法的優(yōu)化和改良提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

倒置熒光數(shù)碼顯微鏡(Olympus，IX71型)，CO2培養(yǎng)箱(Sanyo， MCO-17AC型)，超純水儀(Millipore，Milli-QA10型)，無(wú)菌濾器(Millipore，貨號(hào)SLGP033RB)，細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning公司，貨號(hào)3516)，等。

1.2 主要試劑與溶液

胎牛血清(Gibco，貨號(hào)10099-141)，DMEM(Gibco，貨號(hào)11995-065)，D-Hank’s(Sigma，貨號(hào)H2387)，木瓜蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)G8430)，彈性蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司，39445-21-1)，胰蛋白酶(Amresco，貨號(hào)F746-2)，分散酶II(Worthington，貨號(hào)LS02100)，膠原酶II(Worthington，貨號(hào)4176)，等。

木瓜蛋白酶溶液：用含5mM L-半胱氨酸的生理鹽水配制，濃度0.1%；胰蛋白酶溶液：用D-Hank’s液配制，濃度0.25%；彈性蛋白酶溶液、分散酶II溶液和膠原酶II溶液：均用DMEM配制，濃度均是0.1%；木瓜蛋白酶-胰蛋白酶溶液：用含5mM L-半胱氨酸的生理鹽水配制，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶濃度均為0.1%；胰蛋白酶-彈性蛋白酶溶液：用DMEM配制，胰蛋白酶和彈性蛋白酶濃度均為0.1%；分散酶II-膠原酶II溶液：用DMEM配制，分散酶II和膠原酶II濃度均為0.1%；彈性蛋白酶-膠原酶II組：用DMEM配制，彈性蛋白酶和膠原酶II濃度均為0.1%。

1.3 大鼠肺組織的消化與原代培養(yǎng)

新生SD大鼠5只(購(gòu)自北京市海淀區(qū)興隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖廠)，酒精擦拭消毒，斷頸處死，無(wú)菌打開(kāi)胸腔，取出肺臟，參照相關(guān)文獻(xiàn)[7]，按照下述步驟進(jìn)行處理。置于預(yù)冷D-Hank’s液洗去血污，剪取肺臟邊緣組織，除去臟膜和大的氣管、血管組織，剪成約1 mm3大小的組織塊，隨機(jī)分為木瓜蛋白酶組、胰蛋白酶組、彈性蛋白酶組、分散酶II組、膠原酶II型組、木瓜蛋白酶-胰蛋白酶組、胰蛋白酶-彈性蛋白酶組、分散酶II-膠原酶II組和彈性蛋白酶-膠原酶II組，共9組，各組置于離心管，分別加入組織量5倍體積的相應(yīng)消化酶溶液，于37 ℃水浴鍋消化。

在肺組織消化后第15 min、30 min和60 min時(shí)分別對(duì)各組觀察、拍照，并將各組離心管的肺組織消化物用移液器吹打數(shù)次，使其充分混合和分散。各組消化60 min后，過(guò)70 μm細(xì)胞篩，收集濾液離心，將沉淀用含20% 血清的DMEM完全培養(yǎng)基重懸，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，于含5% CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置孵育2 h后，洗去未貼壁細(xì)胞培養(yǎng)物，對(duì)各組觀察、拍照。

2 結(jié) 果

2.1 不同消化液對(duì)大乳鼠肺組織的消化結(jié)果比較

不同消化液對(duì)大乳鼠肺組織的消化結(jié)果顯示，消化15 min時(shí)，各組肺組織的整體狀態(tài)均無(wú)明顯變化，除木瓜蛋白酶組的肺組織邊緣仍較銳利外，其余各組的肺組織塊邊緣部分均略有蓬松，只有少量的脫落單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)。消化30 min時(shí)，木瓜蛋白酶組肺組織塊僅邊緣部位呈毛糙模糊狀態(tài)；其他各組的肺組織均呈現(xiàn)不同程度的松散狀態(tài)，組織塊的透光性增加，移液器吹打后大多失去完整的塊狀結(jié)構(gòu)。其中，胰蛋白酶組、胰蛋白酶-彈性蛋白酶、彈性蛋白酶-膠原酶II組和分散酶II-膠原酶II組的肺組織蓬松程度和脫落的細(xì)胞量較其他4組更大，吹打后呈黏液團(tuán)狀。消化60 min時(shí)，木瓜蛋白酶組的肺組織塊多呈松散狀，透光性增加，但大部分肺組織仍為團(tuán)塊狀，移液器吹打后不散開(kāi)；其他各組用移液器吹打后均較好地分散，無(wú)較大的塊狀結(jié)構(gòu)。顯微鏡觀察結(jié)果顯示，胰蛋白酶組、胰蛋白酶-彈性蛋白酶組和彈性蛋白酶-膠原酶II組的肺組織消化最為充分，細(xì)胞團(tuán)塊最少，其他5組無(wú)明顯差別(圖1)。

A.木瓜蛋白酶組，B.彈性蛋白酶組，C.分散酶II組，D.胰蛋白酶組，E.膠原酶II型組，F(xiàn).木瓜蛋白酶-彈性蛋白酶組，G.胰蛋白酶-彈性蛋白酶，H.彈性蛋白酶-膠原酶II組，I.分散酶II-膠原酶II組；標(biāo)尺=500 μm圖1 不同酶溶液消化大乳鼠肺組織60 min時(shí)的顯微照片 A. Papain, B. Elastase, C. Dispase II, D. Trypsin, E. Collagenase II, F. Papain-elastase, G. Trypsin-elastase, H. Elastase-collagenase II, I. Dispase II-collagenase II; Bar=500 μmFig.1 Microphotographs of suckling rat lung tissue digested by enzyme solutions for 60 minutes

2.2 大乳鼠肺組織不同酶消化物的細(xì)胞貼壁結(jié)果

為進(jìn)一步了解不同消化液對(duì)細(xì)胞活力的影響，對(duì)各組肺組織消化分離的細(xì)胞進(jìn)行了接種培養(yǎng)。結(jié)果顯示，木瓜蛋白酶組無(wú)明顯貼壁細(xì)胞，分散酶II-膠原酶II組的貼壁細(xì)胞數(shù)最多，其次為胰蛋白酶組、膠原酶II型組和彈性蛋白酶-膠原酶II組，彈性蛋白酶組、分散酶II組和木瓜蛋白酶-彈性蛋白酶組僅有少量的細(xì)胞貼壁；胰蛋白酶-彈性蛋白酶組的單細(xì)胞量雖然在各組中較大，但貼壁細(xì)胞的量顯著少于除木瓜蛋白酶組外的其他各組(圖2)。

3 討 論

為了篩選消化法分離培養(yǎng)大乳鼠肺MVECs的組織消化液，本試驗(yàn)選擇了5種消化酶，分別配制成單一酶消化液或混合酶消化液共9種。其中，0.1%木瓜蛋白酶溶液對(duì)大乳鼠肺組織消化能力最弱，60 min時(shí)僅有少量的單細(xì)胞解離，且?guī)缀鯚o(wú)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，這與文獻(xiàn)報(bào)道其主要應(yīng)用于神經(jīng)組織的細(xì)胞分離相符[8]，鮮見(jiàn)用于肺組織的消化；0.25%胰蛋白酶溶液的消化力雖強(qiáng)于0.1%彈性蛋白酶溶液、0.1%分散酶II溶液和0.1%膠原酶II溶液，且胰蛋白酶溶液與彈性蛋白酶溶液聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)肺組織的消化能力強(qiáng)于本試驗(yàn)所用其他各種消化液，但使用此兩種消化液獲得的貼壁細(xì)胞量卻顯著少于分散酶II-膠原酶II溶液和分散酶II溶液，其原因可能在于，胰蛋白酶的消化作用強(qiáng)烈，在組織或細(xì)胞消化過(guò)程中易造成細(xì)胞損傷[9,10]，甚至造成細(xì)胞的溶解，降低了肺MVECs的活力。

A.木瓜蛋白酶組，B.彈性蛋白酶組，C.分散酶II組，D.胰蛋白酶組，E.膠原酶II型組，F(xiàn).木瓜蛋白酶-彈性蛋白酶組，G.胰蛋白酶-彈性蛋白酶，H.彈性蛋白酶-膠原酶II組，I.分散酶II-膠原酶II組；標(biāo)尺=200 μm圖2 不同酶溶液消化的大乳鼠肺組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物 A. Papain, B. Elastase, C.Dispase II, D. Trypsin, E. Collagenase II, F. Papain-elastase, G. Trypsin-elastase, H. Elastase-collagenase II, I. Dispase II-collagenase II;Bar=200 μmFig.2 Microvascular endothelial cell cultures from suckling rat lung tissue digested by enzyme solutions

本試驗(yàn)選用的5種消化酶中，分散酶II和膠原酶II的活性需要Ca2+的存在[11,12]，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的活性需要EDTA的存在[13,14]，而彈性蛋白酶一般不需要活化劑[15]；木瓜蛋白酶活性的維持需要弱酸環(huán)境[13]，胰蛋白酶、彈性蛋白酶和膠原酶II一般在弱堿性條件下活性較高[12,14]，而分散酶II則在弱酸和弱堿性條件均有良好活性[11]。鑒于此，為了更好地發(fā)揮酶的活性及避免不同酶的互相干擾，本試驗(yàn)選擇了木瓜蛋白酶-彈性蛋白酶、胰蛋白酶-彈性蛋白酶、彈性蛋白酶-膠原酶II、分散酶II-膠原酶II的混合溶液；其他任何兩種或多種酶類(lèi)溶液聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，例如胰蛋白酶和膠原酶II，則需要將兩種溶液分別使用，并在兩次消化步驟間進(jìn)行離心，以去除殘留的前一酶溶液對(duì)后續(xù)酶消化的影響。

肺組織中的細(xì)胞種類(lèi)主要有上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、MVECs和巨噬細(xì)胞等，上皮細(xì)胞等貼壁所需時(shí)間一般較成纖維細(xì)胞和MVECs長(zhǎng)，所以差速貼壁是純化肺MVECs的常用方法[16]，本試驗(yàn)根據(jù)前期實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，在接種培養(yǎng)后2 h除去未貼壁細(xì)胞，結(jié)果表明，在選擇合適的消化酶時(shí)，該時(shí)間點(diǎn)可有足夠數(shù)量的細(xì)胞貼壁。

本試驗(yàn)通過(guò)使用9種不同消化液處理大乳鼠的肺組織，比較分析其消化狀態(tài)和消化物接種培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞量，結(jié)果表明，分散酶II-膠原酶II溶液是培養(yǎng)大乳鼠肺MVECs的最佳組織消化液，于37 ℃水浴消化60 min，能夠?qū)⒎谓M織塊充分地消化解離為單細(xì)胞狀態(tài)，并使消化物保持良好的活性，接種培養(yǎng)2 h后可獲得合適密度的貼壁細(xì)胞。