杜兵帥，張 卿，曹慶芹，邢 宇，秦 嶺，房克鳳*

(北京農(nóng)學(xué)院a. 園林學(xué)院；b. 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院；c. 農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;d. 北京農(nóng)學(xué)院林木分子設(shè)計(jì)育種高精尖創(chuàng)新中心，北京102206)

在被子植物的有性生殖過程中，花粉管釋放的兩個(gè)精細(xì)胞分別與胚囊中的卵細(xì)胞和中央細(xì)胞結(jié)合進(jìn)行雙受精作用，進(jìn)而形成合子和初生胚乳細(xì)胞[1]。合子遵循定向且高度有序的分裂模式，在基因有序的選擇性表達(dá)調(diào)控下，經(jīng)過早期原胚，球形胚，心形胚，魚雷形胚和子葉形胚，最終發(fā)育為成熟的胚胎[2]。胚乳作為雙受精過程中精子與極核結(jié)合形成的滋養(yǎng)組織，主要分為沼生目型胚乳、核型胚乳和細(xì)胞型胚乳[3]。沼生目型胚乳多見于單子葉植物中；核型胚乳先進(jìn)行核分裂，形成多個(gè)游離核，與周圍的細(xì)胞質(zhì)充滿整個(gè)胚囊后形成細(xì)胞壁，再完成細(xì)胞化，進(jìn)而為胚胎的發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)；而細(xì)胞型胚乳則是初生胚乳細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分裂，有規(guī)則的形成細(xì)胞壁，不存在游離核時(shí)期[4]。胚胎發(fā)育至種子的過程與碳水化合物的代謝密切相關(guān)，胚乳又是胚胎生長(zhǎng)發(fā)育所需碳水化合物的主要供體[5-8]，所以兩者的發(fā)育緊密相關(guān)。

板栗(CastaneamollissimaBlume.)為雌雄同株經(jīng)濟(jì)林樹種，雄花為直立葇荑花序，雌花一般單獨(dú)或數(shù)朵生于總苞內(nèi)[9]。板栗雌苞內(nèi)通常有3枚子房，每子房有6～9心室，每心室有兩枚倒生胚珠，共12～18枚胚珠，胚珠雙珠被，且靠子房一側(cè)生長(zhǎng)較快[10]。在這12～18枚胚珠中一般僅有1個(gè)胚珠可以發(fā)育為種子，其余的胚珠后期均敗育。在可以完成受精作用的正常胚珠內(nèi)，具備蓼型胚囊的典型結(jié)構(gòu)[11]?；ǚ勐渲林^上，萌發(fā)長(zhǎng)出花粉管進(jìn)入花柱后，精細(xì)胞與胚囊中卵細(xì)胞結(jié)合完成受精作用形成合子，開始胚胎基本組織的形成和形態(tài)的改變[12]，而這些變化離不開胚乳的支撐，因此在這個(gè)過程中同時(shí)伴隨著胚乳的發(fā)育與消耗[13]。已有研究表明成熟的板栗種子不具胚乳，食用部分為膨大的子葉[14]。因此胚乳的發(fā)育相對(duì)來說十分短暫，但過程多樣且復(fù)雜。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于板栗生殖方面的研究雖然很多，但大多停留在形態(tài)描述、胚胎發(fā)生等方面，在胚胎發(fā)育過程中的4個(gè)關(guān)鍵時(shí)期(球形胚、心形胚、魚雷形胚、子葉形胚)，胚乳以怎樣的形態(tài)存在和變化卻并不十分清楚。

同時(shí)，板栗作為世界著名樹種，種子具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，淀粉、蛋白質(zhì)含量豐富，有“木本糧食”和“干果之王”的美譽(yù)[15]，并且在山區(qū)綠化、促進(jìn)山區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展方面起很大作用。就中國(guó)板栗栽培形勢(shì)而言，種植面積廣泛，但產(chǎn)量和效益相對(duì)較低，這與板栗種子在發(fā)育過程中出現(xiàn)的敗育、空苞有很大的關(guān)系[16, 17]。因此本試驗(yàn)對(duì)板栗種子成熟過程中胚胎及胚乳的變化進(jìn)行研究，以期進(jìn)一步掌握板栗的生殖發(fā)育特征，并為探明板栗結(jié)實(shí)率低的內(nèi)在原因提供解剖學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料采自北京市懷柔板栗試驗(yàn)站，從7月1日至7月25日，每隔5 d采集雌苞，采回后將胚珠從子房中剝出。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 板栗胚珠石蠟切片制作 將胚珠標(biāo)注好日期，放至FAA固定液中固定24 h，用梯度酒精(50%，70%，80%，95%，100%)和二甲苯(50%，100%)進(jìn)行脫水，在最后1次處理后加入切碎的石蠟碎屑至飽和，在42 ℃恒溫箱中過夜；次日在60 ℃恒溫箱中將原液換為純蠟(4.5 h換純蠟2次)，將浸好蠟的胚珠與蠟液一起倒至疊好的紙盒中，用鑷子迅速調(diào)整胚珠的位置，使其冷卻；次日用石蠟切片機(jī)對(duì)包埋好的胚珠進(jìn)行縱切，切片厚度為5～7 μm；在48 ℃恒溫箱中烘片1晚，次日用梯度二甲苯和梯度酒精進(jìn)行脫蠟。

1.2.2 數(shù)據(jù)測(cè)量及分析 將制好的切片用BX51顯微鏡(Olympus)進(jìn)行觀察，用軟件DP2-BSW對(duì)胚乳細(xì)胞徑值進(jìn)行測(cè)量，并用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄分析，計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，最后將結(jié)果輸入Prism軟件，繪制成波形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 板栗胚胎發(fā)育過程形態(tài)解剖觀察

‘懷黃’板栗的盛花期通常在六月中旬，從盛花期到子葉胚的形成需要35～45 d，到果實(shí)完全成熟需要90 d左右。當(dāng)原胚形成后，在之后的發(fā)育過程中胚胎的形態(tài)及組成結(jié)構(gòu)都發(fā)生了明顯的改變：盛花期后15～20 d，胚胎的基本組織(原表皮層、維管組織等)開始形成，胚胎發(fā)育到達(dá)球形期(圖1-a，b；圖a為早球形胚，圖b為晚球形胚)；盛花期后20～25 d，胚體細(xì)胞快速分裂和分化，子葉原基開始形成，胚胎發(fā)育到達(dá)心形期(圖1-c，d)；盛花期后25～30 d，子葉增大，胚胎發(fā)育至魚雷形(圖1-e)；盛花期后35 d左右，胚胎發(fā)育至子葉形(圖1-f，g)，而后，子葉形胚細(xì)胞開始快速擴(kuò)張，子葉形胚膨大增厚，逐漸充滿整個(gè)胚囊(圖1-h)。

2.2 畸形胚胎

在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)存在胚胎形態(tài)畸形的現(xiàn)象，2片子葉在發(fā)育過程中連接在了一起，形成環(huán)形，胚乳細(xì)胞未見明顯橫化趨勢(shì)(圖2-a，b)，同時(shí)，還存在胚胎數(shù)量畸形的現(xiàn)象，在一枚胚珠內(nèi)存在2個(gè)子葉胚，中間有環(huán)形珠被相隔(圖2-c)。

a.早球形胚；b. 晚球形胚；c, d. 心形胚；e. 魚雷形胚；f, g, h. 子葉形胚；箭頭指向胚胎，Bar=100 μm圖1 板栗胚胎發(fā)育過程a, b. Globular embryos；c, d. Heart shaped embryos；e. Torpedo shaped embryos；f, g, h. Cotyledonary embryos；The arrow points to embryos, Bar=100 μmFig.1 Process of chestnut embryonic development

a, b.胚胎形狀畸形；c. 胚胎數(shù)量畸形；箭頭指向胚胎，Bar=100 μm圖2 畸形胚胎 a, b. Abnormal embryos；c. Two embryos in one ovule；The arrow points to embryos, Bar=100 μmFig.2 Malformed embryos

2.3 板栗胚乳發(fā)育過程的形態(tài)解剖觀察

板栗胚乳屬于核型胚乳，在發(fā)育過程中存在游離核細(xì)胞化這一轉(zhuǎn)變過程。盛花期后15～20 d，胚胎剛發(fā)育至早球形胚時(shí)，胚乳仍處于游離核時(shí)期，無細(xì)胞壁包被，同周圍的細(xì)胞質(zhì)共同構(gòu)成胚乳囊(圖3-a)。隨著胚胎的發(fā)育，游離核開始從珠孔端進(jìn)行細(xì)胞化，形成胚乳細(xì)胞(圖3-b)，合點(diǎn)端方向仍為游離核狀態(tài)；盛花期后20～30 d，胚胎從球形向心形和魚雷形發(fā)育的過程中，游離核胚乳的細(xì)胞化沿胚囊壁向合點(diǎn)端進(jìn)行，直至胚乳完全細(xì)胞化，并且充滿整個(gè)胚囊。但同時(shí)由于胚體本身的發(fā)育膨大，會(huì)逐漸水解一部分胚乳，形成胚乳腔(圖3-c，d)；盛花期后35 d左右，胚胎發(fā)育至子葉形，胚體會(huì)從胚乳細(xì)胞中大量吸收營(yíng)養(yǎng)，進(jìn)而導(dǎo)致胚乳細(xì)胞橫向擴(kuò)張，部分已出現(xiàn)解體、細(xì)胞不完整的現(xiàn)象(圖3-e)；伴隨著子葉胚的膨大，胚乳被繼續(xù)消耗、水解，細(xì)胞壁不完整，細(xì)胞質(zhì)減少，進(jìn)入脫水期，直至幾乎被完全吸收(圖3-f)。

a. 盛花期后15 d的游離核胚乳，白色圓圈內(nèi)是胚乳游離核；b. 盛花期后20 d后始細(xì)胞化后的胚乳，白色圓圈內(nèi)是胚乳游離核，白色方框內(nèi)是珠孔端細(xì)胞化后的胚乳；c. 盛花期后25 d的胚乳；d. 盛花期后30 d的胚乳；e. 盛花期后35 d的胚乳；f. 盛花期后45 d的胚乳；箭頭指向胚乳腔，Bar=50 μm圖3 胚乳的發(fā)育過程 a. The free nuclear endosperm of 15 d after anthesis, the free nuclear endospermisenclosed in white circle；b. Cell wall began to form in the endosperm of 20 d after anthesis, the free nuclear endosperm isenclosed in white circle, and endosperm cells of the micropylar end are enclosed in white box；c. Endosperm cells of 25 d after anthesis；d. Endosperm cells of 30 d after anthesis；e. Endosperm cells of 35 d after anthesis；f. Endosperm cells of 45 d after anthesis；The arrow points to endosperm chamber, Bar = 50 μmFig.3 The process of chestnut endosperm development

2.4 不同發(fā)育時(shí)期胚乳細(xì)胞的形態(tài)變化

為了進(jìn)一步探究胚乳細(xì)胞的發(fā)育變化，對(duì)不同時(shí)期胚乳細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行了測(cè)量，包括細(xì)胞的橫徑和縱徑。結(jié)果表明，在盛花期后20 d左右，球形胚時(shí)期，游離核狀態(tài)的胚乳正在從珠孔端向合點(diǎn)端進(jìn)行細(xì)胞化，此時(shí)胚乳細(xì)胞橫徑和縱徑相差不大，徑值均較小(圖4-a，f)。伴隨著胚胎的發(fā)育，胚乳細(xì)胞開始擴(kuò)張，淀粉粒增多，細(xì)胞化的胚乳進(jìn)入成熟期，橫徑和縱徑均有緩慢增加，但兩者仍相差不大(圖4-b，c，f)。在盛花期后35 d左右，胚胎發(fā)育至子葉胚時(shí)，胚乳細(xì)胞出現(xiàn)明顯的橫向擴(kuò)張趨勢(shì)，細(xì)胞的橫徑和縱徑存在明顯的差異(圖4-d，g)。盛花期后40 d左右，隨著子葉胚的膨大，胚乳細(xì)胞繼續(xù)橫向擴(kuò)張，且縱徑值大幅度降低(圖4-e，g)，在為胚胎提供營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)，更有利于子葉胚的膨大。

a.盛花期后20 d的胚乳細(xì)胞；b.盛花期后25 d的胚乳細(xì)胞；c. 盛花期后30 d的胚乳細(xì)胞；d. 盛花期后35 d的胚乳細(xì)胞；e. 盛花期后40 d的胚乳細(xì)胞；f. 細(xì)胞化的胚乳不同發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞徑值變化；Bar=20 μm圖4 胚乳細(xì)胞的形態(tài)觀察及徑值變化a. Endosperm cells of 20 d after anthesis；b. Endosperm cells of 25 d after anthesis；c. Endosperm cells of 30 d after anthesis；d. Endosperm cells of 35 d after anthesis；e. Endosperm cells of 40 d after anthesis； f. Diameters of endosperm cells；Bar=20 μmFig.4 Morphological observation and diameter changes of endosperm cells

3 討 論

在被子植物中，一對(duì)精細(xì)胞分別與卵細(xì)胞和中央細(xì)胞結(jié)合，在胚囊內(nèi)完成雙受精作用形成合子和初生胚乳核，兩者分別以不同的方式進(jìn)行分裂和分化[18, 19]。合子第一次分裂形成二細(xì)胞原胚，而后經(jīng)過四細(xì)胞原胚、八細(xì)胞原胚、三十二細(xì)胞原胚[20, 21]，隨后依次經(jīng)過球形胚、心形胚、魚雷形胚及子葉形胚，最終發(fā)育為成熟的胚胎[22]。而初生胚乳核的分裂早于合子分裂，第一次分裂形成兩個(gè)游離核，且核型胚乳以后進(jìn)行的多次核分裂都不伴有細(xì)胞壁的形成[23, 24]。對(duì)于板栗而言，胚胎作為成熟果實(shí)的主要成分，它的發(fā)育與膨大是板栗果實(shí)體積和重量增加的主要原因[14,16]。與很多植物不同的是，成熟的板栗種子中并沒有胚乳的存在。在本研究中通過對(duì)球形胚、心形胚、魚雷形胚、子葉形胚的觀察，確定了盛花期后胚胎發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)間節(jié)點(diǎn)；同時(shí)觀察了胚乳的形成、發(fā)育到解體的過程。依照Olsen[25]和曠仁平等人[26]對(duì)核型胚乳發(fā)育過程的時(shí)期分類，在本研究中觀察到了胚乳發(fā)育的4個(gè)關(guān)鍵時(shí)期：游離核期、細(xì)胞化期、分化期和死亡期，進(jìn)一步證實(shí)了板栗胚乳具備核型胚乳的典型特征。將胚胎與胚乳的發(fā)育相結(jié)合，研究結(jié)果表明：在球形胚時(shí)期(盛花期后15～20 d)，胚胎細(xì)胞快速進(jìn)行生命活動(dòng)，處于高強(qiáng)度的分化及分裂狀態(tài)，維管組織、表皮等結(jié)構(gòu)開始形成[27, 28]。與此同步的是胚乳游離核向細(xì)胞化的轉(zhuǎn)變(時(shí)期的轉(zhuǎn)變：游離核期向細(xì)胞化期)，且細(xì)胞化具有方向性，沿胚囊壁從珠孔端向合點(diǎn)端進(jìn)行，其細(xì)胞與周圍的胚胎細(xì)胞、珠被細(xì)胞也有明顯的不同。在心形胚和魚雷形胚時(shí)期(盛花期后20～30 d)，球形胚頂端的兩側(cè)細(xì)胞加速分裂形成子葉原基，游離核胚乳完全細(xì)胞化，全部形成細(xì)胞；淀粉粒作為主要的營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)藏物質(zhì)，數(shù)量明顯增多。胚乳細(xì)胞迅速擴(kuò)張，橫縱徑值均增加，體積增大；為了讓胚胎更好的發(fā)育，胚乳腔形成(胚乳分化期)。子葉胚及子葉胚膨大時(shí)期(盛花期后35 d)，胚乳細(xì)胞橫向擴(kuò)張明顯，細(xì)胞橫徑值持續(xù)增加，但縱徑值減小，兩者相差較大，并伴隨著胚胎的膨大開始逐漸被水解，此時(shí)期有逐漸被胚消化的胚乳細(xì)胞殘余物的存在(胚乳死亡期)。有研究表明，有的植物胚胎在早期胚胎發(fā)育過程中，胚乳并不是主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來源[29]。從本試驗(yàn)的研究結(jié)果可以表明，板栗胚的發(fā)育滯后于胚乳的發(fā)育，且在胚胎發(fā)育過程中時(shí)，胚乳細(xì)胞富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，到達(dá)成熟胚時(shí)，胚乳僅剩細(xì)胞殘余物(即死亡期)。因此可以推斷板栗胚胎發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)主要依賴于胚乳細(xì)胞所提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

板栗的種子存在一定的空癟率，造成種子空癟的原因較為復(fù)雜，在板栗胚胎和胚乳的發(fā)育過程中，所觀察到的形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的形態(tài)畸形的胚胎，其胚乳細(xì)胞并未發(fā)生明顯的橫化，也并未觀察到胚乳腔的存在，畸形胚胎是否能正常從胚乳細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)還有待研究，但很可能是造成種子空癟的一個(gè)重要原因[30-32]。而對(duì)于存在的2枚胚胎的情況，推測(cè)是由于在板栗的12～18枚胚珠中有2枚胚珠完成了雙受精作用，因這2枚胚珠在同一心室，珠柄端相隔較近，導(dǎo)致2枚胚珠的珠柄粘合，繼而可能發(fā)育成為常見的“雙胞胎”。

本研究通過對(duì)胚胎發(fā)生及胚乳發(fā)育的過程的研究，揭示了兩者在發(fā)育過程中的動(dòng)態(tài)聯(lián)系，并通過畸形胚胎對(duì)板栗種子敗育的影響作了相關(guān)探討，進(jìn)一步掌握了板栗的生殖發(fā)育特征。