王豕辰，徐 珺，董 恒，李金堯，侯曉林

(北京農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)也稱金葡菌，是革蘭氏陽性菌代表，致病性僅次于沙門氏菌和副溶血桿菌[1]。它可以產(chǎn)生多種毒力因子[2]，刺激細(xì)胞發(fā)生凋亡[3]，產(chǎn)生局部炎癥，造成大量感染甚至威脅畜禽生命[4]。有研究表明，金葡菌通過激活細(xì)胞膜上TLR2受體，從而激活下游細(xì)胞信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。芒果苷又稱莞知母寧，藥理作用廣泛，具有抗炎、抑菌、抗腫瘤等作用[6]。據(jù)報道，芒果苷可以通過抑制腦神經(jīng)元細(xì)胞凋亡來減輕腦組織缺血再灌注時的損傷[7]，其還可以抑制促凋亡蛋白的表達(dá)從而保護(hù)高糖誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞損傷[8]。但是，芒果苷對金葡菌誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞凋亡的抑制作用及其作用機(jī)制尚少見報道。

本試驗建立了金葡菌刺激后RAW264.7細(xì)胞凋亡模型，通過檢測芒果苷對細(xì)胞凋亡相關(guān)因子和蛋白表達(dá)探索芒果苷是否具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，從而為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)，購自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心；金葡菌ATCC29213購自上海北諾生物技術(shù)科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)；胎牛血清(Gibco)；雙抗(Gibco)；MH肉湯培養(yǎng)基(海博生物，中國)；甘油(索萊寶，中國)；二甲基亞砜(DMSO)(Sigam,美國)；芒果苷>98%(阿拉丁，中國)；四唑鹽(MTT)(Amresco，美國)；ELISA試劑盒(Raybiotech,，美國)；Caspase-3活性檢測試劑盒(碧云天，中國)細(xì)胞全蛋白提取試劑盒(凱基，中國)；BCA蛋白含量檢測試劑盒(凱基，中國)；Bax、Bcl-2、Caspase-3、β-actin一抗(CST，美國)；脫脂奶粉(Oxoid，英國)；Alexa Fluor 488抗兔熒光二抗(Life Technologies，美國)。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，根據(jù)細(xì)胞數(shù)目形態(tài)1～2 d傳代1次，保持細(xì)胞處于對數(shù)生長期。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng) 金葡菌在MH肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 h后，10倍梯度稀釋9～10次后，取100 μL涂板計數(shù)，20%甘油凍存，-80 ℃保存。

1.2.3 芒果苷對金葡菌最小抑菌濃度測定 采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測[9]。

1.2.4 MTT比色法檢測細(xì)胞活力 根據(jù)實驗指南步驟[10]檢測細(xì)胞活力。

1.2.5 金葡菌感染細(xì)胞 試驗分為5組：空白處理作為對照組(C)，金葡菌感染作為模型組(SA)，芒果苷低(25 μmol/L)、中(50 μmol/L)、高(100 μmol/L)濃度預(yù)處理作為加藥組。細(xì)胞以4×105個/孔鋪至6孔板，置于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)12 h后，加入25、50、100 μmol/L 芒果苷作用1h后，以感染復(fù)數(shù)MOI=100∶1(細(xì)菌∶細(xì)胞)的比例加入金葡菌作用 4h。

1.2.6 檢測Caspase 3活性 同“1.2.5”處理細(xì)胞。收集細(xì)胞，根據(jù)Caspase-3活性檢測試劑盒說明書測定細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活性。

1.2.7 ELISA檢測細(xì)胞因子 同“1.2.5”處理細(xì)胞。取細(xì)胞上清液，根據(jù)ELISA試劑盒說明書分別測定細(xì)胞分泌的IL-10、IL-6和TNF-α濃度量。

1.2.8 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 同“1.2.4”處理細(xì)胞。使用細(xì)胞全蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞全蛋白，同時用BCA蛋白含量檢測試劑盒定量所提取全蛋白的蛋白濃度。配制濃度為5%的濃縮膠和15%的分離膠。每個樣品上樣量為20 μg蛋白。恒壓80 V，電泳120 min。濕法恒流250 mA，轉(zhuǎn)膜120 min。5%脫脂奶粉封閉60 min。4 ℃孵育一抗過夜。熒光二抗避光孵育40 min。利用奧德賽雙色紅外激光成像系統(tǒng)對待測膜進(jìn)行掃描、成像。使用Imgae J進(jìn)行灰度值定量分析。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 試驗結(jié)果使用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)是3個平行樣本的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié) 果

2.1 金葡菌最小抑菌濃度測定結(jié)果

按照國標(biāo)測定方法檢測芒果苷對金葡菌ATCC29213的最小抑菌濃度，結(jié)果顯示，256μg/mL以下濃度的芒果苷對其不具有抑菌作用。用于后續(xù)細(xì)胞試驗中的最高濃度為200 μmol/L(84.4μg/mL)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于256 μg/mL。

2.2 芒果苷和金葡菌對RAW264.7細(xì)胞毒性試驗結(jié)果

為了研究芒果苷和金葡菌對RAW264.7細(xì)胞的毒性，篩選芒果苷作用細(xì)胞的最適濃度和金葡菌作用細(xì)胞時間點。取不同濃度芒果苷作用細(xì)胞24 h，采用MTT法檢測細(xì)胞活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，120 μmol/L組的細(xì)胞活力明顯下降，100 μmol/L以下濃度的芒果苷對RAW264.7細(xì)胞沒有明顯的毒性作用(圖 1-A)，因此后期試驗選用25、50、100 μmol/L 的芒果苷對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理。金葡菌取不同時間點感染細(xì)胞，采用MTT法檢測細(xì)胞活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與0 h組相比，感染4 h組細(xì)胞的活力明顯下降(圖 1-B)，因此用感染復(fù)數(shù)MOI=100∶1(細(xì)菌∶細(xì)胞)刺激RAW264.7細(xì)胞4 h作為細(xì)胞凋亡模型。

圖1 芒果苷和金葡菌對RAW264.7細(xì)胞毒性Fig.1 Mangiferin and Staphylococcus aureus are toxic to RAW264.7 cells

2.3 芒果苷抑制金葡菌誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)

為了檢測芒果苷對金葡菌誘導(dǎo)RAW264.7促炎細(xì)胞因子的分泌，采用ELISA試劑盒檢測IL-6、IL-10、TNF-α的表達(dá)。結(jié)果如圖 2-A-C所示，與對照組(C)相比，模型組(SA)的IL-6、IL-10和TNF-α均呈現(xiàn)顯著上調(diào)，加入芒果苷預(yù)處理后，其呈現(xiàn)顯著下調(diào)且具有濃度依賴性。同時檢測了細(xì)胞內(nèi)Caspase-3的活性，結(jié)果與上述結(jié)果相同(圖 2-D)。

圖2 芒果苷對金葡菌侵染RAW264.7細(xì)胞引起炎癥因子表達(dá)和Caspase-3活化的影響Fig.2 The effect of Mangiferin on theexpression of inflammatory factors and caspase-3 activation induced by Staphylococcus aureus infection of RAW264.7 cells

圖3 芒果苷對金葡菌侵染RAW264.7細(xì)胞引起細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.3 The effect of Mangiferin on the expression of apoptosis related proteins caused by Staphylococcus aureus infection of RAW264.7 cells

2.4 芒果苷抑制金葡菌誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

為了進(jìn)一步探討芒果苷對金葡菌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響，采用Western blot檢測與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax, Bcl-2, Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果如圖3所示，與對照組(C)相比，模型組(SA)Bax, Caspase-3蛋白的表達(dá)量呈現(xiàn)顯著上調(diào)，加入芒果苷預(yù)處理后，呈現(xiàn)明顯下調(diào)且具有濃度依賴性。

3 討 論

細(xì)胞凋亡是多種細(xì)胞因子和蛋白共同參與的生理病理過程，是細(xì)胞主動實施的程序性死亡[11]。細(xì)胞凋亡的激活包括兩種途徑：一種是死亡受體途徑，如Fas-FasL[12]；另一種是線粒體途徑[13]，如抑制細(xì)胞凋亡的基因Bcl-2等和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因Bax等[14]。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時，促炎癥因子分泌增加，抗炎癥因子分泌減少[15]，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白相互作用，激活下游Caspase家族蛋白，Caspase家族蛋白是可以直接造成細(xì)胞凋亡的一類蛋白酶系統(tǒng)[16]。有研究表明，金黃色葡萄球菌可以誘導(dǎo)人單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞凋亡。

芒果苷是一種四羥基吡酮的碳糖苷，具有抗炎和抗凋亡等多種藥理特性。研究證明，芒果苷可以降低肝損傷小鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6和IL-10的表達(dá)水平，從而起到緩解肝損傷的作用[19, 20]。芒果苷可以通過抑制Bax和Caspase-3發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用減緩創(chuàng)傷性顱腦損傷[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，金葡菌刺激RAW264.7細(xì)胞時，細(xì)胞炎性因子IL-10，IL-6，TNF-α的分泌量明顯增加，Bax，Caspase-3的蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，而芒果苷可以顯著降低其炎性因子的分泌和促凋亡蛋白的表達(dá)。

芒果苷可以通過降低Bax蛋白和Caspase-3蛋白表達(dá)量，緩解金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的凋亡。