謝心悅，賈慧慧，楊海清，高坦坦，魏艷敏，任爭光*

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，北京農(nóng)學(xué)院，北京 102206；2.北京市平谷區(qū)人民政府果品辦公室，北京 101200)

長期以來，植物病蟲害的防治都是以化學(xué)防治為主?；瘜W(xué)農(nóng)藥的廣泛使用雖然提高了農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)效率，但是也存在著對生態(tài)環(huán)境危害大，農(nóng)藥殘留等一些嚴(yán)重問題。因此，生物防治的方法越來越受到大家的關(guān)注[1]。芽胞桿菌(Bacillussp.)是目前植物病害生物防治研究和應(yīng)用最多的生防菌種類之一[2]。芽胞桿菌在自然界中廣泛存在，是土壤和植物微生態(tài)的優(yōu)勢微生物種群之一，多數(shù)為對人畜無害的非致病菌。芽胞桿菌突出的特征是能產(chǎn)生芽胞，芽胞的特殊結(jié)構(gòu)使其具有很強的抗逆性和較好的穩(wěn)定性，這有利于生防菌的存活與繁殖，對于生防菌劑的生產(chǎn)和劑型的加工也很重要[3-4]。芽胞桿菌對多種植物病害具有很好的控制效果，其對植物病害的生防機制主要為競爭、拮抗、誘導(dǎo)抗性、溶菌作用和促進植物生長等[5]。芽胞桿菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)主要有抗生素、抗菌蛋白、細菌素、細胞壁降解酶類等[6]。

本試驗從北京農(nóng)學(xué)院試驗地分離到一株芽胞桿菌BJ-10，對BJ-10進行了分子生物學(xué)鑒定，檢測了該菌株的抑菌譜，抗菌物質(zhì)的抗逆性等，并利用盆栽試驗檢測了BJ-10發(fā)酵液對甜瓜白粉病和細菌性果斑病的防治能力。試驗結(jié)果為生防芽胞桿菌BJ-10的進一步開發(fā)和利用提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株BJ-10分離自北京農(nóng)學(xué)院東大地菜園土壤中，初步認(rèn)定為芽胞桿菌(Bacillussp.)。菌株BJ-10用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)和保存，需要時，發(fā)酵培養(yǎng)基為：可溶性淀粉20 g、麩皮10 g、CaCO310 g、Na2HPO32 g、KH2PO31 g，溶于1 000 mL去離子水中，分裝后在121 ℃下高壓滅菌。

供試植物病原真菌：草莓褐色葉斑病菌(Pilidiumconcavum)、草莓褐色輪紋病菌(Sphaeronaemellafragariae)、棒形擬盤多毛孢(Pestalotiopsisclavispora)、葡萄潰瘍病菌(Botryosphaeriadothidea)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、草莓炭疽菌(Colletotrichumfragariae)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、鐘器腐霉(Pythiumvexans)和蘋果樹腐爛病菌(Valsamali)共9株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)；供試甜瓜細菌性果斑病菌(Acidovoraxcitrulli)在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)和保存；供試甜瓜白粉病菌保存在甜瓜幼苗上。

1.2 方 法

1.2.1 芽胞桿菌BJ-10的分子生物學(xué)鑒定 芽胞桿菌BJ-10在LB液體培養(yǎng)基中37 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，用細菌DNA快速提取試劑盒(購自北京艾德萊生物科技有限公司)提取BJ-10的總DNA，以此為模板，利用gyrB基因鑒定引物gyrB-up1f/gyrB-up2r進行PCR擴增[7]，PCR產(chǎn)物送測序公司(生工生物工程(上海)股份有限公司)測序。所得序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中用Blastn軟件比對分析，并用MEGA 5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.2 芽胞桿菌BJ-10的抑菌譜測定 芽胞桿菌BJ-10的抑菌譜測定采用對峙培養(yǎng)法。具體步驟為：從培養(yǎng)好的植物病原真菌平板中打取直徑為5 mm的菌餅，放置在PDA平皿中央，在距離菌餅3.0 cm處滴加5 μL BJ-10的LB培養(yǎng)液；對甜瓜細菌性果斑病菌拮抗時，將培養(yǎng)好的病原細菌混入LB培養(yǎng)基中，在平皿中央滴加5 μL BJ-10培養(yǎng)液；28 ℃培養(yǎng)3～5 d，觀察并測量抑菌帶寬度并計算抑菌效果。抑菌效果=(抑菌帶寬度/生防菌距離菌餅的距離)×100%。

1.2.3 芽胞桿菌BJ-10的抗菌物質(zhì)耐熱性與耐酸堿性測定 將菌株BJ-10用發(fā)酵培養(yǎng)基于28 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，發(fā)酵液用過濾器除去細菌，分別在35、45、55、65、75、85、95 ℃下水浴處理20 min，及121 ℃高壓處理20 min，然后以蘋果樹皮腐爛病菌(V.mali)為指示菌，在PDA平皿距離菌餅3 cm處打孔，加入100 μL不同溫度處理的發(fā)酵液，28 ℃培養(yǎng)，3 d后測量抑菌帶寬度并計算抑菌效果。耐酸堿性測定時，將發(fā)酵液調(diào)至pH=3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，處理12 h后再調(diào)回初始pH值(pH約6.7)，以V.mali作為指示菌，測定抑菌活性變化。

1.2.4 芽胞桿菌BJ-10對甜瓜白粉病和細菌性果斑病的防治試驗 芽胞桿菌BJ-10對甜瓜白粉病和細菌性果斑病的防治試驗采用室內(nèi)盆栽處理的方法。首先，挑選籽粒飽滿的健康甜瓜種子(綠翠品種)種植到營養(yǎng)缽中育苗，待幼苗長出1～2片真葉后備用。將菌株BJ-10用發(fā)酵培養(yǎng)基于28 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)液用紗布過濾殘渣后，添加1‰的吐溫80，稀釋5倍制備成5-1倍帶菌發(fā)酵液，用細菌過濾器過濾制備成5-1倍無菌發(fā)酵液。

采集室內(nèi)甜瓜苗上培養(yǎng)的白粉病菌，用毛筆將分生孢子刷入無菌水中，調(diào)至2×106CFU/mL；用毛筆將孢子懸浮液均勻刷于待測甜瓜葉片上，放溫室中保濕培養(yǎng)6 d左右。設(shè)置20%三唑酮乳油1 000倍液、BJ-10的5-1倍帶菌發(fā)酵液和5-1倍無菌發(fā)酵液處理，空白發(fā)酵培養(yǎng)基稀釋5倍液作為對照，噴霧處理發(fā)病甜瓜葉片，每處理重復(fù)3盆(每盆4～5棵)，溫室培養(yǎng)6～8 d，調(diào)查白粉病的發(fā)生情況。病情指數(shù)和防治效果計算參見汪軍等(2017)[8]。防治甜瓜細菌性果斑病時，設(shè)置空白LB培養(yǎng)基對照、農(nóng)用硫酸鏈霉素1 000倍液、新植霉素1 000倍液，BJ-10的5-1倍帶菌發(fā)酵液和5-1倍無菌發(fā)酵液共5個處理，先噴霧處理生防菌和藥劑，再噴霧接種細菌性果斑病菌，保濕培養(yǎng)5～8 d，計算甜瓜苗的病情指數(shù)和防治效果，具體參見周洪友等(2009)[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽胞桿菌BJ-10的菌落形態(tài)與分子鑒定結(jié)果

從北京農(nóng)學(xué)院東大地菜園土壤中分離到細菌BJ-10，其單菌落乳白色，圓形，邊緣不整齊，表面有褶皺(圖1)，這與某些芽胞桿菌(Bacillussp.)的菌落形態(tài)生長一致，初步認(rèn)定為芽胞桿菌。為了進一步鑒定芽胞桿菌BJ-10的分類地位，本試驗PCR擴增了BJ-10的gyrB基因，經(jīng)電泳檢測到了1 000 bp左右條帶，將PCR產(chǎn)物測序后在NCBI數(shù)據(jù)庫中用Blastn軟件比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BJ-10與解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)相似率最高，達到99%以上。從NCBI網(wǎng)站下載gyrB基因相關(guān)序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示BJ-10和解淀粉芽胞桿菌聚在一個分支(圖2)，因此BJ-10初步鑒定為解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)。

2.2 芽胞桿菌BJ-10的抑菌譜測定結(jié)果

利用對峙生長法測定了芽胞桿菌BJ-10對9株病原真菌和甜瓜細菌性果斑病菌的拮抗活性，結(jié)果顯示(表1)，BJ-10對所測植物病原菌均具有不同程度的拮抗活性，特別是對草莓炭疽菌(C.fragariae)、草莓褐色輪紋病菌(S.fragariae)和蘋果樹腐爛病菌(V.mali)的拮抗效果最好，抑菌帶寬度達到了10 mm以上，抑菌效果在35%左右；其次是甜瓜細菌性果斑病菌(A.citrulli)，抑菌帶寬度達到了8.8 mm，抑菌效果為29%；對立枯絲核菌(R.solani)抑制作用最弱，為3.7 mm，抑菌效果為12.3%左右。

圖1 芽胞桿菌BJ-10的菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of Bacillus sp. BJ-10

圖2 基于芽胞桿菌gyrB基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic rooted tree based on sequence analysis of gyrB gene of BJ-10 and related Bacillus strains

表1 芽胞桿菌BJ-10對不同病原菌的拮抗作用Tab.1 The antagonism of BJ-10 on different pathogen

2.3 芽胞桿菌BJ-10抗菌物質(zhì)熱穩(wěn)定性和耐酸堿性檢測結(jié)果

將芽胞桿菌BJ-10過濾后的無菌發(fā)酵液在35～121 ℃不同溫度下處理，檢測抗菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無菌發(fā)酵液在不同溫度處理下對V.mali均具有拮抗活性(表2)，在75 ℃以下處理，抗菌活性變化較小，85～121 ℃處理后活性開始下降，121 ℃高壓處理20 min后抑菌帶寬度仍能達到4.7 mm，抑菌效果為15.7%，為常溫對照處理的72.3%。這說明芽胞桿菌BJ-10能分泌抗菌物質(zhì)到發(fā)酵液中，抗菌物質(zhì)具有較強的熱穩(wěn)定性。將無菌發(fā)酵液調(diào)至不同pH值處理12 h，再調(diào)回初始pH，測定抑菌活性，結(jié)果顯示：經(jīng)不同pH處理后的抗菌物質(zhì)均保留有一定的抑菌活性(表2)，發(fā)酵液中的抗菌物質(zhì)在經(jīng)中性或堿性(pH=7.0和pH=9.0)處理后抑菌活性最高，但在酸性或強堿處理下，活性顯著下降。

表2 不同溫度和pH處理的芽胞桿菌BJ-10發(fā)酵液對蘋果樹腐爛病菌的抑菌活性Tab.2 The antimicrobial activities to Valsa mali of BJ-10 fermentation filtrate by different temperature and different pH treating

2.4 芽胞桿菌BJ-10對甜瓜白粉病和細菌性果斑病的防治效果

采用盆栽的方法檢測了芽胞桿菌BJ-10對甜瓜白粉病的防治效果，結(jié)果顯示(表3)，與空白培養(yǎng)基對照處理的病情指數(shù)100相比，BJ-10的5-1倍無菌發(fā)酵液處理的甜瓜白粉病病情指數(shù)為23.3，防效達到了76.7%，而5-1倍帶菌發(fā)酵液防效達到了80.0%，與三唑酮農(nóng)藥處理防效相同。以上結(jié)果說明芽胞桿菌BJ-10的發(fā)酵液稀釋5倍用能較好的防治甜瓜白粉病，且?guī)Ьl(fā)酵液處理效果更好。采用先噴霧接種生防菌和農(nóng)藥處理，再接種病原菌的方法檢測芽胞桿菌BJ-10對甜瓜細菌性果斑病的防治效果。結(jié)果顯示(表3)，芽胞桿菌BJ-10發(fā)酵液稀釋5倍后對甜瓜細菌性果斑病仍有較好的防效，無菌發(fā)酵液防效達到了87.5%，而帶菌發(fā)酵液為94.4%，和兩種化學(xué)農(nóng)藥的防效相近。

表3 芽胞桿菌BJ-10對甜瓜白粉病和細菌性果斑病的防治效果

Tab.3 The efficiency ofBacillussp. BJ-10 in prevention of melon powdery mildew and bacterial fruit blotch disease

處理病情指數(shù)防效%白粉病細菌性果斑病白粉病細菌性果斑病對照(CK)100a45.6a0.0a0.0a20%三唑酮乳油1000倍液20.0b—80.0b—新植霉素1000倍液—0.6d—98.6b農(nóng)用硫酸鏈霉素1000倍液—0.3d—99.4bBJ-10的5-1倍帶菌發(fā)酵液20.0b2.6c80.0b94.4bBJ-10的5-1倍無菌發(fā)酵液23.3b5.7b76.7b87.5c

3 結(jié)論與討論

芽胞桿菌是植物病害生物防治研究中的重要微生物之一，其種類多，分布廣泛，是土壤和植物微生態(tài)中的優(yōu)勢種群[10]。研究最多的是枯草芽胞桿菌(B.subtilis)，其次為蘇云金芽胞桿菌(B.thuringiensis)，然后是蠟狀芽胞桿菌(B.cereus)、地衣芽胞桿菌(B.licheniformis)、巨大芽胞桿菌(B.megaterium)、短小芽胞桿菌(B.breves)和解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)等[11-14]。本試驗從北京農(nóng)學(xué)院試驗田菜園土壤中分離到一株生防菌BJ-10，該菌株菌落形態(tài)同芽胞桿菌形態(tài)一致。近代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為細菌的分類與鑒定提供了高效的方法，如16S rDNA基因序列廣泛應(yīng)用于細菌鑒定或構(gòu)建細菌的系統(tǒng)進化關(guān)系上，但是在親緣關(guān)系很近的分類類群間，16S rDNA基因序列間因相似度太高難以進行區(qū)分和鑒定[15]。近年來不斷有新的蛋白編碼基因作為細菌鑒定標(biāo)記來彌補16S rDNA序列的不足，比如DNA促旋酶B亞基編碼基因gyrB[16]。gyrB基因的進化速率大于16S rRNA基因，因而也非常適合近緣種的鑒定[7]。本試驗直接用gyrB基因作為BJ-10的分子生物學(xué)指標(biāo)，經(jīng)過序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析初步確定BJ-10為解淀粉芽胞桿菌。然而，細菌的生理生化指標(biāo)是其分類和鑒定的重要參考，因此菌株BJ-10分類地位真正的確立尚需對其生理生化特性進行確定。

芽胞桿菌能夠產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，主要包括脂肽類抗生素和拮抗蛋白兩大類。這些抗菌物質(zhì)在拮抗病原菌和植物病害防治方面具有重要作用[6]。此外，芽胞桿菌還能通過競爭作用和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性等機制防治植物病害[5, 6]。本試驗篩選到的芽胞桿菌BJ-10對測試的9株病原真菌和1株病原細菌都具有拮抗活性，說明其能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)。對BJ-10的發(fā)酵液進行了不同溫度和酸堿度處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗菌物質(zhì)有較好的熱穩(wěn)定性和一定的耐酸堿性，而這些特性特別符合環(huán)脂肽類抗菌素的特征。芽胞桿菌產(chǎn)生的環(huán)脂肽類抗菌物質(zhì)，如伊枯草菌素(Iturin)和泛革素(Fengycin)家族等，具有環(huán)狀肽鏈結(jié)構(gòu)的特點，賦予了其較強的抗逆性能[17]。在對甜瓜白粉病和甜瓜細菌性果斑病的盆栽防病試驗中，發(fā)現(xiàn)了無論帶菌或無菌發(fā)酵液均對甜瓜白粉病和甜瓜細菌性果斑病有較好的防效，其中BJ-10帶菌發(fā)酵液防效更好，這不僅說明了BJ-10產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)在這兩個病害防治方面起到了重要作用，還說明了BJ-10的防病作用可能還有另外的機制，比如競爭機制或誘導(dǎo)抗病能力等。因此，芽胞桿菌BJ-10的抗菌物質(zhì)組成、競爭或誘導(dǎo)植物抗病機制就成為了下一步研究的重點?？傊?，芽胞桿菌BJ-10是一株抑菌譜廣，抗菌物質(zhì)穩(wěn)定，具有較好的防病能力，具有巨大開發(fā)潛力的生防菌株。