劉 菲，蔣 燚，姜 英，劉雄盛，黃榮林，宋 倩，韋鑠星，黃 云，蔣 琳

（1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院 廣西優(yōu)良用材林資源培育重點實驗室 國家林業(yè)和草原局中南速生材繁育實驗室，廣西南寧 530002；2.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學院，廣西南寧 530007；3.廣西國有六萬林場，廣西玉林 537000；4.廣西國有黃冕林場，廣西柳州 545600）

錳（Mn）是植物生長發(fā)育必須的元素，在植物的氮代謝和光合過程等方面發(fā)揮著重要的作用。Mn也是許多重要酶類物質(zhì)的激活物，是構(gòu)成光合作用中水解酶的基本組分之一，適量的Mn有益于維持植物正常的生理代謝，缺錳則影響植物的光合作用和地上部分干物質(zhì)積累[1-2]，同時對植物代謝產(chǎn)生重要影響。江南油杉（Keteleeria fortunei var.cyclolepis）為我國特有種，在我國的廣西、福建、廣東、湖南、貴州、浙江、江西和云南等南方地區(qū)海拔300～1 000 m的山地有天然分布，是松科（Pinaceae）油杉屬高大常綠針葉喬木，為油杉（K.fortunei）的變種[3]。其適應性強，主干端直，樹型美觀，木材硬度適中、紋理通直、結(jié)構(gòu)細致和耐腐蝕性強，是眾多行業(yè)發(fā)展（如建筑、造船和家具等）所需的優(yōu)良珍貴木材[4]。部分國內(nèi)學者在江南油杉的生態(tài)學特征[5-6]和植物學特性[7-8]方面開展了研究，得到了江南油杉群落結(jié)構(gòu)分化明顯、垂直分布穩(wěn)定和優(yōu)勢地位明顯等結(jié)論。還有一些學者在江南油杉的優(yōu)樹選擇方法[9-10]、幼苗培育技術[11-12]、苗期抗旱生理特征[13]和栽培技術[14-15]等方面開展了諸多研究，發(fā)現(xiàn)江南油杉適應性強，能適應一定程度的重度干旱脅迫，后期生長迅速，可對其擴大利用。但低Mn環(huán)境對江南油杉的影響未見相關報道，本研究通過人為控制Mn含量，探索江南油杉苗期在低Mn環(huán)境下的生理響應特征，旨在為江南油杉培育中Mn的施用及江南油杉的保護提供理論依據(jù)，補充江南油杉抗逆理論。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院科研苗圃（108°21′E，22°56′N），地處廣西南寧市北郊，海拔約90 m，屬丘陵地帶，成土母質(zhì)為寒武紀砂巖，土壤為赤紅壤，年均氣溫21.6℃，≥10℃年積溫7 200℃，最低氣溫-2.1℃，最高氣溫40.4℃，干濕季明顯，屬濕潤北熱帶季風氣候，年均降水量1 347.2 mm，平均相對濕度80%左右，5—9月為雨季，月平均降水量100 mm以上；10月—翌年4月為旱季，月平均降水量80 mm以下。

1.2 試驗材料

材料為項目組2016年從田林縣收集的江南油杉種子繁育的幼苗，于2016年10—11月對優(yōu)樹進行球果采摘，隨后在陰涼干燥處將球果晾干，并將種子從果殼中剝出，2017年2月在沙床進行催芽，3月將已生根的幼苗移栽至5 cm×9 cm的無紡布輕基質(zhì)育苗袋中，基質(zhì)配比為椰糠∶珍珠鹽=1∶3，并統(tǒng)一放入育苗托盤，進行常規(guī)育苗管理。

1.3 研究方法

脅迫處理采用Hoagland營養(yǎng)液[16]+MnCl2·4H2O為脅迫溶液。共設3個處理，以Hoagland營養(yǎng)液（營養(yǎng)液配方中含9.146 μmol/L MnCl2）培養(yǎng)的幼苗作為對照（CK），并設置T1中度低Mn（20% 營養(yǎng)液）、T2重度低Mn（5%營養(yǎng)液）作為脅迫處理。每處理4次重復，每重復5株。將江南油杉幼苗整株放入玻璃容器內(nèi)，置于光線充足且通風良好處，加入足量處理溶液，以沒過植株基部為準，放入通氣泵，24 h通氣，每3 d更換1次相應濃度的處理溶液。脅迫開始時間為2018年8月7日，試驗開始后測定每株江南油杉幼苗的株高和地徑，共取樣2次，分別于第10 d（8月17日）和第20 d（8月26日）上午8:00～11:30測定株高、地徑生長量和生物量，并取成熟葉片和根系保存至-10℃冰箱備用，以測定生理指標。

1.4 指標測定

使用鋼卷尺對幼苗株高（H）進行測量（精確至0.1 cm）；使用數(shù)顯游標卡尺對幼苗地徑（D）進行測量（精確至0.01 mm）[17]。在處理開始前和處理結(jié)束后分別測量每株江南油杉幼苗的株高和地徑，分別記為H始和D始，及H終和D終。運用公式△H=H終-H始和△D=D終-D始，計算株高生長量和地徑生長量，其中△H為株高生長量，△D為地徑生長量。

采用收獲取樣法[15]測定生物量，在試驗結(jié)束時分別采集各處理幼苗的根、莖和葉，先在烘箱105℃下殺青15 min，然后調(diào)節(jié)溫度為85℃，烘至質(zhì)量恒定，待自然冷卻后分別測定各器官絕干后的質(zhì)量，以莖和葉的生物量之和為地上部分生物量，根的生物量為地下部分生物量，各組分生物量之和為總生物量。

采用丙酮浸提法[18]測定葉綠素總含量，采用烘干稱量法[18]測定葉片相對含水量，采用電導率法[19]測定細胞膜透性，采用蒽酮比色法[16]測定葉片可溶性總糖含量，采用酸性茚三酮法[16]測定葉片脯氨酸含量，采用硫代巴比妥酸法[19]測定丙二醛（MDA）含量，采用NBT光還原法[19]測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用愈創(chuàng)木酚法[19]測定過氧化物酶（POD）活性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007和Origin Pro 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理與分析。采用SPSS 19.0軟件進行方差分析及LSD比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 低Mn環(huán)境對江南油杉幼苗生長的影響

與CK相比，幼苗在低Mn環(huán)境下10 d時，葉片出現(xiàn)部分褪綠和發(fā)黃現(xiàn)象，少部分葉片出現(xiàn)掉落現(xiàn)象，部分植株莖部略有發(fā)黑，根部顏色未見明顯變化；20 d時，褪綠和發(fā)黃葉片的數(shù)量較10 d時增加，葉片掉落加劇，植株莖部和根部發(fā)黑數(shù)量增多，發(fā)黑程度略有加重。株高和地徑生長量隨Mn濃度降低逐漸下降（圖1）。10 d時，T1處理的株高和地徑生長量較CK分別下降11.20%和1.55%，T2處理分別下降30.25%和9.53%；20 d時，T1處理的株高和地徑生長量較CK分別下降47.85%和26.41%，T2處理分別下降52.12%和36.88%。20 d時，CK的株高和地徑生長量較10 d時分別上升60.50%和66.46%；T1處理的株高生長量較10 d時小幅下降（2.23%），地徑生長量上升24.43%；T2處理的株高和地徑生長量較10 d時分別上升14.29%和16.13%。10 d時，各處理間的株高和地徑生長量均差異不顯著；20 d時，CK的株高生長量與T1和T2處理差異顯著（P＜0.05），各處理間的地徑生長量均差異不顯著。20 d時各處理的株高和地徑生長量與10 d時差異不顯著。

圖1 低Mn環(huán)境對江南油杉幼苗株高和地徑生長量的影響Fig.1 Effects of low manganese environment on increments of plant height and ground diameter of K.fortunei var.cyclolepis seedlings

2.2 低Mn環(huán)境對江南油杉幼苗生物量的影響

幼苗地上部分生物量、地下部分生物量和總生物量隨Mn濃度降低逐漸下降（圖2）。10和20 d時，CK、T1和T2處理的地上部分生物量、地下部分生物量和總生物量均為CK＞T1＞T2。10 d時，T1處理的地上部分生物量、地下部分生物量和總生物量較CK分別下降29.95%、22.24%和27.28%，T2處理分別下降39.60%、29.66%和36.16%。20 d時，T1處理的地上部分生物量、地下部分生物量和總生物量較CK分別下降21.65%、67.74%和40.00%，T2處理分別下降38.22%、70.67%和51.14%；CK的地上部分生物量、地下部分生物量和總生物量較10 d時分別上升4.15%、30.14%和13.15%；T1處理的地上部分生物量較10 d時上升16.50%，地下部分生物量和總生物量分別下降46.02%和6.64%；T2處理的地上部分生物量較10 d時上升6.52%，地下部分生物量和總生物量分別下降45.73%和13.41%。10 d時，各處理間的地上部分生物量和地下部分生物量均差異不顯著，CK與T2處理的總生物量差異顯著（P＜0.05）。20 d時，CK的地上部分生物量與T2處理差異顯著（P＜0.05），與T1處理差異不顯著；CK的地下部分生物量和總生物量與T1和T2處理均差異極顯著（P＜0.01）；T1與T2處理間的地上部分生物量、地下部分生物量和總生物量均差異不顯著。20 d時各處理的地下部分生物量、地上部分生物量和總生物量與10 d時差異不顯著。

圖2 低Mn環(huán)境對江南油杉幼苗生物量的影響Fig.2 Effects of low manganese environment on biomass of K.fortunei var.cyclolepis seedlings

2.3 低Mn環(huán)境對江南油杉幼苗膜脂過氧化和細胞膜透性的影響

隨著Mn濃度降低，幼苗的MDA含量逐漸上升（圖3）。10 d時，T1和T2處理的MDA含量較CK分別增加12.89%和13.83%；20 d時，T1和T2處理的MDA含量較CK分別增加16.01%和67.26%；CK與T1處理在20 d時的MDA含量較10 d時分別下降29.72%和27.78%，T2處理較10 d時增加3.27%。10 d時，各處理間的MDA含量均差異不顯著；20 d時，T2處理與CK和T1處理差異顯著（P＜0.05）；20 d時各處理的MDA含量與10 d時差異不顯著。

電導率隨Mn濃度降低逐漸升高（圖4）。10 d時，T1和T2處理的電導率分別比CK高20.69%和28.01%；20 d時，T1和T2處理的電導率分別比CK高34.10%和111.87%；20 d時，T2處理的電導率較10 d時上升37.63%，T1處理下降7.60%。10 d時，各處理間的電導率均差異不顯著；20 d時，CK的電導率與T2處理差異極顯著（P＜0.01）；20 d時各處理的電導率與10 d時差異不顯著。

圖3 低Mn環(huán)境對江南油杉幼苗MDA含量的影響Fig.3 Effects of low manganese environment on MDA content of K.fortunei var.cyclolepis seedlings

圖4 低Mn環(huán)境對江南油杉幼苗電導率的影響Fig.4 Effectsoflowmanganeseenvironmenton conductivity of K.fortunei var.cyclolepis seedlings

2.4 低Mn環(huán)境對江南油杉幼苗葉綠素總含量的影響

幼苗葉綠素總含量隨Mn濃度的降低逐漸下降（圖5）。10 d時，各處理葉綠素總含量為CK＞T1＞T2，T1與T2處理的葉綠素總含量較CK分別下降17.69%和22.75%；20 d時，T1與T2處理的葉綠素總含量較CK分別下降2.71%和3.95%；20 d時CK、T1和T2處理的葉綠素總含量較10 d時分別增加2.62%、21.30%和27.59%。10 d時，CK的葉綠素總含量與T1和T2處理差異顯著（P＜0.05）；20 d時，各處理間的葉綠素總含量均差異不顯著；20 d時T1與T2處理的葉綠素總含量與10 d時差異顯著（P＜0.05）；20 d時CK的葉綠素總含量與10 d時差異不顯著。

圖5 低Mn環(huán)境對江南油杉幼苗葉綠素總含量的影響Fig.5 Effects of low manganese environment on total content of chlorophyll of K.fortunei var.cyclolepis seedlings

2.5 低Mn環(huán)境對江南油杉幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

Mn濃度降低的環(huán)境下，10 d時，幼苗的脯氨酸含量呈先上升后小幅下降的趨勢，T1和T2處理的脯氨酸含量較CK分別上升42.25%和39.95%；20 d時，脯氨酸含量呈逐漸上升的趨勢，T1和T2處理的脯氨酸含量較CK分別上升57.45%和76.55%；20 d時CK、T1和T2處理的脯氨酸含量較10 d時分別上升27.95%、41.62%和61.41%（圖6）。10 d和20 d時，各處理間的脯氨酸含量均差異不顯著，20 d時各處理的脯氨酸含量與10 d時差異不顯著。

幼苗的可溶性糖含量在Mn濃度下降的情況下，10 d時呈上升趨勢，20 d時呈下降趨勢（圖7）。10 d時，T1和T2處理的可溶性糖含量較CK分別上升25.43%和30.15%，20 d時分別下降12.13%和30.08%。20 d時，CK與T1處理的可溶性糖含量較10 d時分別上升57.87%和10.59%，T2處理下降15.18%。10 d時，CK的可溶性糖含量與T2處理差異顯著（P＜0.05）；20 d時，CK的可溶性糖含量與T2處理差異極顯著（P＜0.01）；20 d時CK的可溶性糖含量與10 d時差異極顯著（P＜0.01），其他處理20 d時的可溶性糖含量與10 d時差異不顯著。

圖6 低Mn環(huán)境對江南油杉幼苗脯氨酸含量的影響Fig.6 Effects of low manganese environment on proline content of K.fortunei var.cyclolepis seedlings

圖7 低Mn環(huán)境對江南油杉幼苗可溶性糖含量的影響Fig.7 Effects of low manganese environment on soluble sugar content of K.fortunei var.cyclolepis seedlings

2.6 低Mn環(huán)境對江南油杉幼苗保護酶活性的影響

幼苗SOD活性隨Mn濃度降低整體呈先上升后下降的趨勢（圖8）。10 d時，SOD活性為T1＞T2＞CK，T1和T2處理的SOD活性較CK分別增加62.47%和49.75%；20 d時，SOD峰值在T1處理中出現(xiàn)，T1和T2處理的SOD活性較CK分別增加75.11%和39.81%。20 d時CK、T1和T2處理的SOD活性較10 d時分別下降39.24%、34.51%和43.27%。10 d和20 d時，各處理間的SOD活性均差異不顯著；各處理在20 d時的SOD活性與10 d時均差異不顯著。

幼苗POD活性隨Mn濃度降低呈逐漸下降的趨勢（圖9）。10 d時CK的POD活性較T1和T2處理分別增加0.75%和33.18%，20 d時分別增加12.42%和30.49%；20 d時CK、T1和T2處理的POD活性較10 d時分別增加87.74%、65.66%和95.30%。10 d和20 d時，各處理間的POD活性均差異不顯著；各處理20 d時的POD活性與10 d時均差異顯著。

圖8 低Mn環(huán)境對江南油杉幼苗SOD活性的影響Fig.8 Effects of low manganese environment on SOD activity of K.fortunei var.cyclolepis seedlings

圖9 低Mn環(huán)境對江南油杉幼苗POD活性的影響Fig.9 Effects of low manganese environment on POD activity of K.fortunei var.cyclolepis seedlings

3 結(jié)論與討論

隨著Mn濃度降低，江南油杉幼苗的生長受到抑制。株高和地徑生長量、地上部分生物量、地下部分生物量和總生物量隨Mn濃度降低逐漸下降，這與武泰存等[20]對小麥（Triticum aestivum）的研究結(jié)果相似。細胞受損和膜脂過氧化程度加重，葉綠素總含量逐漸降低；脯氨酸含量在短時間內(nèi)隨Mn濃度降低呈先上升后小幅下降的趨勢，隨著脅迫時間增加，含量逐漸上升；可溶性糖含量在短時間內(nèi)隨Mn濃度降低呈上升趨勢，隨著脅迫時間增加，含量逐漸下降；SOD活性呈先上升后下降的趨勢，POD活性逐漸下降。

Mn元素參與光合作用中水裂解氧及葉綠素合成的過程，植物在缺Mn環(huán)境下，易造成葉綠體細胞膜成分（糖脂和多聚不飽和脂肪酸等）含量的下降和結(jié)構(gòu)性變差[21-23]。江南油杉幼苗葉綠素總含量在低Mn環(huán)境下，短時間內(nèi)下降顯著，隨著脅迫時間的增加，各處理間的葉綠素總含量差異程度下降，可能是由于幼苗葉片細胞的質(zhì)膜受到損害，導致細胞質(zhì)膜透性下降，不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化作用，產(chǎn)生MDA[24]，導致膜脂過氧化程度加重，葉綠素的合成受抑制程度加劇。

植物在逆境下，會在體內(nèi)發(fā)生一系列復雜的生理過程，積累大量脯氨酸和可溶性糖等滲透物質(zhì)，以調(diào)節(jié)與維持植物生長[25-26]。在短時間的低Mn環(huán)境下，重度低Mn處理下江南油杉幼苗的脯氨酸含量較中度低錳時略有下降，可溶性糖顯著積累，可能是由于短時間重度低錳環(huán)境抑制幼苗吸收鎂、鈣和鐵等其他元素，造成元素平衡被打破，抑制了脯氨酸的積累，引發(fā)可溶性糖逐漸積累并在滲透調(diào)節(jié)中發(fā)揮主要作用[2,27]。糖類是植物光合作用所轉(zhuǎn)化能量的儲存形式，光合作用與植物可溶性糖的積累息息相關[28]，隨著脅迫時間增加，葉綠素總含量下降導致可溶性糖的積累受到影響，含量顯著下降，此時脯氨酸含量雖有上升，但變化并不顯著。

SOD和POD是植物體內(nèi)清除活性氧自由基并保護植物的重要酶，可清除植物體內(nèi)的活性氧，保護細胞膜結(jié)構(gòu)，對緩解逆境對植物造成的損傷具有重要作用，其活性變化能有效反映植物在逆境下的適應能力[29]。SOD每分子含1個Mn原子[30]，本研究中，SOD活性峰值在T1處理中出現(xiàn)，隨后活性下降，可能與重度低Mn環(huán)境下Mn元素的缺乏有關。POD與光合作用和呼吸作用等生理過程密切相關，可以清除逆境脅迫下植物體內(nèi)產(chǎn)生的H2O2，緩解或抵御植物逆境脅迫引起的損害[31]。本研究中，Mn濃度降低造成POD活性逐漸下降，可能與葉綠素含量下降有關，這與張鄭偉等[31]對水稻（Oryza sativa）在Mn素脅迫下的研究結(jié)果相似。

綜上所述，江南油杉幼苗在低Mn環(huán)境下的響應策略主要為降低植株生長、降低葉綠素合成、提升脯氨酸含量進行植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)和提升SOD活性消除植物體內(nèi)的活性氧，使其能一定程度適應低Mn環(huán)境。

本研究的試驗場所位于科研苗圃，其氣候條件與生產(chǎn)所處條件基本一致，研究所得的結(jié)論可作為江南油杉苗期抗逆理論的補充，為研究、生產(chǎn)和應用提供參考。植物抗逆生理是一個復雜的過程，本研究未對江南油杉幼苗在低Mn環(huán)境下的各生理指標變化是否與其他元素變化存在相應關系開展相關試驗，可在下一步開展深入研究，并運用生物技術挖掘相應的調(diào)控基因，優(yōu)化江南油杉幼苗在低Mn環(huán)境下的保存率，提高在Mn含量較低區(qū)域造林的成活率。