梁曉靜，朱昌叁，安家成，李開祥，曾祥艷，楊卓穎，余玉珠

（1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 廣西特色經(jīng)濟(jì)林培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣西木本香料工程技術(shù)研究中心國家林業(yè)和草原局八角肉桂工程技術(shù)研究中心，廣西南寧 530002；2.廣西國有欽廉林場，廣西欽州 535099）

樟樹（Cinnamomum camphora）為我國特有的油材兩用樹種，有重要的自然價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]，按樟樹葉精油的主成分可將其劃分為腦樟、芳樟、龍腦樟、油樟和異樟等化學(xué)類型[2]。不同化學(xué)類型樟樹的扦插繁殖技術(shù)不盡相同[3-5]。

前人對樟樹的扦插技術(shù)研究主要集中于芳樟[6]和龍腦樟[7-8]。芳樟是油用樟樹的重要變種，曲芬霞[9]研究認(rèn)為，4年生芳樟母株的插穗在混合基質(zhì)（蛭石∶珍珠巖∶清水河沙 =1∶1∶2）中，配合使用NAA（100 mg·L-1·2h-1），生根率可達(dá) 85%。葉東星[10]比較不同基質(zhì)對芳樟扦插成活率的影響，結(jié)果表明，采用20%泥碳土+20%鋸末+57%黃心土+3%過磷酸鈣的配方處理，扦插成活率最高，可達(dá)88.07%。芳樟扦插技術(shù)雖已取得一些成就，但其扦插成活率仍未達(dá)到較高水平，說明在一定條件下芳樟能扦插繁殖,但較為困難。加快芳樟苗木繁殖速度，滿足苗木需求，是當(dāng)前迫切需要解決的問題。一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)植物的扦插生根特征與其插穗解剖結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[11-12]，芳樟扦插生根困難的原因在解剖學(xué)上的研究尚屬空白。

本研究采用小葉芳樟（Cinnamomum camphora var.linaloolifera）為研究材料，優(yōu)化篩選外源激素濃度、留葉方式、插穗直徑和扦插基質(zhì)配方，開展提高小葉芳樟扦插成活率的技術(shù)研究，并從不定根發(fā)生和發(fā)育的形態(tài)解剖學(xué)入手，探討扦插生根機(jī)理，為制定小葉芳樟扦插無性繁殖技術(shù)措施提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為2013年栽植于廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院種植圃（108°21′E，25°56′N）的芳樟優(yōu)良單株。該單株為小葉芳樟實(shí)生優(yōu)株，生長快速，葉精油主成分為芳樟醇且比例穩(wěn)定在85%以上。扦插時(shí)間為2017年9月。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依次開展不同激素濃度、留葉方式、插穗直徑及基質(zhì)對扦插生根的影響研究。

不同激素濃度試驗(yàn)：在優(yōu)樹上選取當(dāng)年生半木質(zhì)化健壯枝條，采用北京艾比蒂生物科技有限公司生產(chǎn)的生長調(diào)節(jié)劑GGR6，配制濃度為0（CK）、50、100、200和250 mg/L，扦插基質(zhì)為純黃心土。

不同留葉方式：插穗上部留雙葉、單葉和2半葉，用最佳GGR6濃度浸泡2 h，扦插基質(zhì)為純黃心土。

不同插穗直徑：選擇粗度一致，直徑約為2、4和8 mm的插穗，采取最佳留葉方式，用最佳GGR6濃度浸泡2 h，扦插基質(zhì)為純黃心土。

不同基質(zhì)試驗(yàn)：采用最佳留葉方式和直徑的插穗，用最佳GGR6濃度浸泡2 h，選擇黃心土、泥炭、珍珠巖和崗松（Baeckea frutescens）糠4種常見基質(zhì)作為配比材料，采用4因素3水平正交設(shè)計(jì)研究不同基質(zhì)對扦插生根的影響，共設(shè)9個(gè)處理（表1）。

表1 不同基質(zhì)配比（體積比）Tab.1 Different substrates(volume ratio)

將裝有基質(zhì)的育苗盤擺放成苗床形式，扦插前2 d用0.3%高錳酸鉀溶液對基質(zhì)進(jìn)行淋灌消毒，塑料薄膜覆蓋；扦插前1 d揭開薄膜，用清水澆透基質(zhì)。制穗長度為8～10 cm，上切口為平口，下端斜切且盡量靠近葉結(jié)處。制好的插穗放入0.3%多菌靈水溶液中消毒，取出后用蒸餾水沖洗干凈。每處理54株插穗，3次重復(fù)。

1.3 扦插后管理

扦插后，淋透水并覆蓋塑料薄膜保濕。每天早上定時(shí)打開封閉的苗床通氣60 min，每隔10 d左右噴灑1次0.2%多菌靈，以防病蟲害侵染，并及時(shí)清理干枯的落葉。

1.4 石蠟切片制作方法

扦插28 d后開始陸續(xù)生根，60 d后結(jié)束；扦插后80 d，調(diào)查不同插穗的生根情況，統(tǒng)計(jì)生根數(shù)，計(jì)算生根率。研究插穗不定根的發(fā)生和發(fā)育過程。扦插前切取插穗基部1 cm莖段，扦插后每7 d隨機(jī)抽取插穗制作石蠟切片。

從插穗基部切取的新鮮組織用FAA固定，用酸性軟化液軟化植物木質(zhì)纖維7 d左右，再經(jīng)系列濃度酒精脫水、二甲苯透明和石蠟包埋，置于石蠟切片機(jī)（德國徠卡RM2455）上切片，片厚4～10 μm。經(jīng)番紅-固綠對染后，用光學(xué)樹膠封藏，制成永久切片，顯微鏡（奧林巴斯CX41）鏡檢，并進(jìn)行圖像采集分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010及SPSS 18.0進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下小葉芳樟插穗生根率的方差分析

不同激素濃度、留葉方式、插穗直徑及基質(zhì)處理下，小葉芳樟插穗生根率均差異極顯著（P＜0.01），表明不同處理對扦插生根有極顯著影響（表2）。

表2 不同處理下小葉芳樟插穗生根率的方差分析Tab.2 Variance analysis on rooting rates of C.camphora var.linaloolifera cuttings among different treatments

2.2 不同激素濃度對小葉芳樟扦插生根的影響

不同激素濃度對小葉芳樟扦插生根的影響均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），插穗生根率均顯著高于CK（圖1）。其中100 mg/L處理的生根率最高（92.59%），比CK高53.10%；其次為50 mg/L處理（82.09%），比CK高35.70%。

在完全學(xué)分制環(huán)境下，授課教師面臨很多新問題和挑戰(zhàn)。大學(xué)生的創(chuàng)新意識和創(chuàng)新能力是高等教育人才培養(yǎng)的重要內(nèi)容。大學(xué)第二課堂——實(shí)踐類教學(xué)活動(dòng)是實(shí)現(xiàn)學(xué)生創(chuàng)新能力培養(yǎng)的關(guān)鍵。本文將創(chuàng)新實(shí)踐類課程授課分為課前視頻學(xué)習(xí)、課堂訓(xùn)練內(nèi)化、課后固化三個(gè)層次。創(chuàng)新實(shí)踐課程經(jīng)過翻轉(zhuǎn)后，增加了師生、生生互動(dòng)和個(gè)性化接觸時(shí)間，課堂成為學(xué)生進(jìn)行項(xiàng)目訓(xùn)練、解決問題的場所，學(xué)生在“做中學(xué)”中理解與應(yīng)用理論、學(xué)習(xí)理論，最大限度地完成知識內(nèi)化。

圖1 不同激素濃度處理對小葉芳樟桿插生根的影響Fig.1 Effects of different hormone concentrations on cuttage rooting of C.camphora var.linaloolifera

2.3 不同留葉方式對小葉芳樟扦插生根的影響

葉是植物進(jìn)行光合作用并制造營養(yǎng)的器官，可為插穗不定根形成提供能量，且能合成對生根有促進(jìn)作用的激素，不同留葉方式對扦插生根有重要影響[13]。留雙葉的小葉芳樟插穗生根率（90.74%）比留2半葉的生根率高18.55%，比單葉的生根率高27.83%，差異顯著（P＜0.05）；留2半葉和留單葉的生根率之間差異不顯著（圖2）。

圖2 不同留葉方式對小葉芳樟扦插生根的影響Fig.2 Effects of different patterns of left leaves on cuttage rooting of C.camphora var.linaloolifera

2.4 不同插穗直徑對小葉芳樟扦插生根的影響

插穗直徑對扦插生根有一定影響，一般認(rèn)為，直徑較小的插穗木質(zhì)化程度低，更容易生根；直徑較大的插穗木質(zhì)化程度高，雖然含有更多營養(yǎng)物質(zhì)，但也含有較高濃度的生根抑制物質(zhì)[13]。小葉芳樟不同直徑插穗的生根率差異顯著（P＜0.05），直徑約4 mm的插穗生根率最高（91.97%），比直徑2 mm的高10.37%，比直徑8 mm的高41.90%（圖3）。直徑約4 mm的插穗木質(zhì)化程度適中，相對2 mm的插穗具有更多的營養(yǎng)物質(zhì)，相對8 mm的插穗，抑制生根物質(zhì)濃度低，為插穗的適宜直徑（圖3）。

2.5 不同基質(zhì)處理對小葉芳樟扦插生根的影響

植物插穗根系的生長發(fā)育與插穗基質(zhì)的配方密切相關(guān)。不同處理中，小葉芳樟插穗生根率最高的為處理 9（黃心土∶泥炭∶珍珠巖 =3∶2∶1）（97.53%），與其他處理差異顯著（P＜0.05）；其次是處理8（黃心土∶泥炭∶崗松糠 =3∶1∶2）和處理7（黃心土∶珍珠巖∶崗松糠 =3∶2∶1），分別為92.59%和91.98%；處理6（黃心土∶泥炭∶崗松糠 =2∶2∶1）生根效果最差（61.73%）（圖4）。

圖3 不同插穗直徑對小葉芳樟扦插生根的影響Fig.3 Effects of different cutting diameters on cuttage rooting of C.camphora var.linaloolifera

圖4 不同基質(zhì)處理對小葉芳樟扦插生根的影響Fig.4 Effects of different substrate treatments on cuttage rooting of C.camphora var.linaloolifera

2.6 小葉芳樟扦插生根解剖學(xué)觀察

通過觀察小葉芳樟的生根方式，發(fā)現(xiàn)插穗的切口無愈傷組織形成，為單一皮部生根類型。扦插21 d后，插穗基部上方插入基質(zhì)的部位出現(xiàn)褐色凸起，但這些凸起最終未形成不定根，原因有待進(jìn)一步研究；28 d后，不定根發(fā)生部位出現(xiàn)在切口上方0.1～1 cm處，分布在插穗一側(cè)；42 d后逐漸分布在基部四周，形成完整根系（圖5）。由于生根時(shí)間久，扦插20 d后插穗基部容易逐漸變黑和切口腐爛，葉片枯萎，原因可能是病原菌通過插穗下切口侵入，造成木質(zhì)部褐化。

對扦插前莖段橫切面的解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)其由3部分組成，分別為周皮、皮層和維管束組織系統(tǒng)（圖6a）。周皮以內(nèi)為皮層，皮層細(xì)胞呈圓形或橢圓形，排列疏松，有較大細(xì)胞核；皮層以內(nèi)為維管束組織系統(tǒng)，由韌皮部、維管束形成層、木質(zhì)部和髓組成，未發(fā)現(xiàn)潛伏根原基，說明插穗在母株上的生長過程中，沒有產(chǎn)生原始根原基。

不定根發(fā)生于木質(zhì)部和韌皮部之間維管束形成層的薄壁細(xì)胞（圖6b）；薄壁細(xì)胞恢復(fù)分生能力，大量分裂，排列密集，形成誘導(dǎo)根原始體（圖6c）；不斷分裂后的分生組織細(xì)胞沿韌皮射線伸展方向穿越皮層，最終伸出莖外（圖6d）；完成維管系統(tǒng)分化的不定根與莖中的維管組織相連，形成具有根冠、分生區(qū)和伸長區(qū)的根。

圖5 小葉芳樟扦插生根過程中的形態(tài)特征Fig.5 Morphological characteristics during cuttage rooting of C.camphora var.linaloolifera

圖6 小葉芳樟不定根發(fā)生過程的解剖學(xué)觀察Fig.6 Anatomical observation of adventitious roots of C.camphora var.linaloolifera

3 結(jié)論與討論

葉東星[10]的研究認(rèn)為在廈門8—10月適合芳樟扦插，3—6月由于穗條木質(zhì)化的原因，扦插成活率低。南寧地處熱帶亞熱帶地區(qū)，8月晝夜溫度仍較高，插穗在長達(dá)1個(gè)月以上的生根過程中，極易發(fā)霉腐爛，本研究初步對比了不同月份下小葉芳樟的扦插成活率，選擇溫度更適宜的9月開展扦插，可提高扦插成活率。

芳樟插穗無原始根原基，需要選擇合適的外源生長調(diào)節(jié)劑濃度誘導(dǎo)根原始體發(fā)生。本研究選擇氨基酸類復(fù)合生根劑GGR6，配制不同濃度進(jìn)行插穗處理，經(jīng)過處理的插穗生根率均顯著大于CK；當(dāng)濃度為100 mg/L時(shí)，生根率最高；隨著濃度升高，生根率降低，高濃度外源生長調(diào)節(jié)劑可能抑制生根。本試驗(yàn)中，留雙葉插穗的扦插成活率高于留2半葉和單葉的成活率，留雙葉既可進(jìn)行光合作用為插穗提供足夠營養(yǎng)，又能進(jìn)行蒸騰作用，為插穗提供足夠水分。當(dāng)年生半木質(zhì)化枝條插穗直徑在4 mm左右，生根率最高；直徑2 mm插穗太細(xì)，水分和養(yǎng)分貯存不足，容易萎蔫死亡；直徑8 mm插穗過粗，木質(zhì)化程度高，抑制生根物質(zhì)多，生根率下降。試驗(yàn)選用成本低且易獲得的黃心土、泥炭、珍珠巖和崗松糠作為扦插育苗基質(zhì)，得到最佳基質(zhì)配比（黃心土∶泥炭∶珍珠巖 =3∶2∶1），該處理提供了插穗生長所需的營養(yǎng)成分，提高了插穗生根率，并且降低了黃泥比重，更加輕便，方便運(yùn)輸。

扦插生根類型有皮部生根型、愈傷組織生根型和混合生根型3種，其中混合生根型兼具皮部生根和愈傷組織生根，這種生根類型的植物較容易生根。本研究中，小葉芳樟的扦插生根類型屬于單一皮部生根型，即從皮部長出不定根，切口無愈傷組織形成。這與曲芬霞[9]的研究結(jié)果不同，其認(rèn)為芳樟為愈傷組織生根型，這可能與試驗(yàn)材料有關(guān)，芳樟不同種質(zhì)類型或無性系的扦插生根類型存在多樣性，其生根機(jī)理存在一定差異，需進(jìn)一步研究。

有潛伏根原始體的植物生根容易，沒有潛伏根原始體的生根較難[14]。小葉芳樟屬于誘導(dǎo)原始體，扦插前的莖段中無潛伏根原基，不定根由維管束形成層細(xì)胞分化而成，與側(cè)柏（Platycladus orientalis）[15]、白皮松（Pinus bungeana）[16]、歐美雜種山楊（Pop?ulus tremula×P.tremuloides）[17]和金花茶（ Camellia chrysantha）[18]等的研究結(jié)果相似。有研究認(rèn)為，插穗生根困難與靠近韌皮部的皮層中存在數(shù)層纖維細(xì)胞構(gòu)成的厚壁有關(guān)，在費(fèi)約果（Feijoa sellowiana）[11]和板栗（Castanea mollissima）[19]等研究中均發(fā)現(xiàn)了厚壁細(xì)胞，其對根原基的生長有機(jī)械阻礙作用，是插穗生根困難的原因之一。小葉芳樟皮層中不存在厚壁組織，因此推測影響小葉芳樟生根的原因不是厚壁組織，生根方式單一且無原始根原基是其扦插生根難和生根時(shí)間久的主要原因。

在確定較適宜扦插季節(jié)的前提下，通過進(jìn)行不同處理試驗(yàn)，最終篩選出最佳的扦插組合為直徑4 mm的半木質(zhì)化插穗，保留2片完整葉子，經(jīng)100 mg/L GGR6處理2 h，在混合基質(zhì)（黃心土∶泥炭∶珍珠巖=3∶2∶1）中培育7～8周，扦插成活率可達(dá)97.53%。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，適合小葉芳樟扦插的時(shí)間范圍較窄，對其規(guī)模化扦插繁育影響較大，可適當(dāng)選擇其他時(shí)間進(jìn)行扦插試驗(yàn)，優(yōu)化試驗(yàn)方案，并從扦插后管理的角度出發(fā)，探索更科學(xué)合理的插后管理技術(shù)，提高插穗生根率，擴(kuò)大扦插時(shí)間范圍。