李夢琦，張可心，鄭飛云，鈕成拓，劉春鳳，李 崎，王金晶＊

（1.江南大學生物工程學院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學釀酒科學與工程研究室，江蘇 無錫 214122）

基因功能研究常用策略為基因編輯技術(shù)，即基因敲除、敲減或過表達、敲入?；蛩窖芯勘硇褪腔蚬δ苎芯砍Ｓ梅椒?，成簇規(guī)律間隔性短回文序列（Cluster regularly interspaced short palindrome repeats，CRISPR）技術(shù)因操作簡便、快速、高效，無種屬限制，成為基因功能研究熱點和常用工具。

CRISPR-Cas 系統(tǒng)是細菌和古細菌在長期演化過程中獲得的適應性免疫系統(tǒng)[1]。主要有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三種類型，Ⅰ和Ⅲ型需多種Cas蛋白共同協(xié)助，而CRISPR-CasⅡ（CRISPR-Cas9）僅需單一Cas9 蛋白，在真核生物和原核生物中直接作RNA 引導基因組編輯系統(tǒng)[2-3]，CRISPR-Cas9 系統(tǒng)應用更廣泛。CRISPR-Cas 技術(shù)已應用于植物[4-5]、哺乳動物[6-7]。在微生物中，傳統(tǒng)方法難以遺傳操作細菌染色體中，CRISPR-Cas技術(shù)被成功應用[8-9]，在酵母中該技術(shù)實現(xiàn)高效率基因編輯[10-11]。目前在真核細胞中應用CRISPR-Cas 系統(tǒng)主要由兩部分構(gòu)成，向?qū)NA（Single-guide RNA, sgRNA）和Cas 蛋白。sgRNA 代替CRISPR 間隔序列轉(zhuǎn)錄形成tracrRNA:crRNA復合物，由Cas蛋白引導并結(jié)合到目標基因靶點前間隔子相鄰基序列（Protospacer adjacent motif,PAM）區(qū)域，將靶位點DNA鏈切割導致DNA雙鏈斷裂（Double strains break,DSB）。形成DSB 通常通過非同源末端連接（Non-homologous end joining,NHEJ）和同源重組（Homology-directed repair,HDR）方式修復，將目的基因敲除。

啤酒酵母根據(jù)其酵母種類分為拉格（Lager）型和艾爾（Ale）型兩大類，工業(yè)啤酒生產(chǎn)菌株多為lager型啤酒酵母[12]。利用這類酵母發(fā)酵啤酒口感清爽、純凈，其中典型菌株如Pilsner 菌株是皮爾森型啤酒生產(chǎn)菌種。Lager 型啤酒酵母（S.pasteurianus）全基因組測序結(jié)果表明該酵母為異源多倍體雜交種，其中一個親本為釀酒酵母（S. cerevisiae），另一個親本為真貝酵母（S. eubayanus）[13-14]。在S. cerevisiae基因編輯研究中，CRISPR-Cas 編輯系統(tǒng)較成熟且應用廣泛[15]，另有同源重組基因編輯系統(tǒng)和Cre-loxP基因編輯系統(tǒng)等。S. eubayanus基因注釋不完善，研究多用傳統(tǒng)育種手段，S.eubayanus基因編輯系統(tǒng)研究較少。Lager 酵母雜倍性，傳統(tǒng)釀酒酵母單倍體菌株多采用基因工程手段在啤酒酵母中適用性低，采用傳統(tǒng)同源重組方法難以完全將目的基因敲除，前期基因功能研究基于部分基因調(diào)控[16]，或以S.cerevisiae為模式菌株開展研究。因此，這些方法不能對某些功能基因在啤酒酵母中作用開展深入研究。Lager酵母經(jīng)長期復雜雜交過程，基因組中發(fā)生多次基因水平改變。對Lager酵母全基因組測序發(fā)現(xiàn)不同Lager 酵母間存在基因變異[17]，本研究針對典型Lager 型啤酒酵母Pilsner 中靶基因作CRISPRCas9 系統(tǒng)sgRNA 設(shè)計構(gòu)建。將CRISPR-Cas9 系統(tǒng)應用于Lager 酵母，降低Lager 酵母基因編輯難度，為其基因功能研究提供便利。與其他基因編輯方法相比，CRISPR-Cas9系統(tǒng)存在于原核生物體內(nèi)免疫防御系統(tǒng)，識別精準度高于蛋白質(zhì)對于核酸序列識別，敲除過程中只要有一個堿基無法正確配對即無法切割靶序列。該系統(tǒng)可一次性敲除多個等位基因，提高敲除成功率。本研究在啤酒酵母S.pasteurianus中建立CRISPR-Cas9 基因編輯系統(tǒng)，以TRP1 基因為靶向基因，獲得TRP1 缺陷菌株。該方法可一次性敲除多個等位基因，實現(xiàn)啤酒酵母雜倍體菌株中基因編輯。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和培養(yǎng)基

啤酒酵母Pilsner，由江南大學釀酒科學與工程研究室保藏；大腸桿菌宿主菌E.coli JM109 購自TaKaRa公司；質(zhì)粒pMY 、YEp352-PAK 由本研究室保藏；質(zhì)粒pRCC- K 購自addgene（由北京中原合聚經(jīng)貿(mào)有限公司代理）。質(zhì)粒YEp352-PAK 由質(zhì)粒YEp352 改造得到，在原始質(zhì)?；A(chǔ)上，替換來源于S.cerevisiae基因組PGK1 啟動子和ADH1 終止子[18]。質(zhì)粒pMY由質(zhì)粒pMD19-T 與產(chǎn)甘油假絲酵母（Candida glycerinogenes）基因組中一段1.2 kb 長度5.8 SrDNA 基因片段、GAP 啟動子、AOX 終止子和基因URA5整合而成[19]。

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g·L-1，酵母抽提物5 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，固體培養(yǎng)基添加20 g·L-1瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min。若為篩選培養(yǎng)基則需另添加氨芐青霉素至終濃度100 μg·mL-1或另添加卡那霉素至終濃度50 μg·mL-1。

YPD 培養(yǎng)基：酵母抽提物10 g·L-1，蛋白胨20 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，115 ℃滅菌15 min。固體培養(yǎng)基添加20 g·L-1瓊脂粉，115 ℃滅菌15 min。篩選培養(yǎng)基則需添加G418 至終濃度200 μg·mL-1。

1.1.2 主要試劑

大腸桿菌感受態(tài)制備試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶、DNA Maker、PrimeSTAR Max DNA Polymerase, rTaq 聚合酶購自TaKaRa公司；Phanta Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Cycle Pure Kit PCR 純化試劑盒購自美國Omega Bio-Tek 公司；HieffCloneTM Plus One Step Cloning Kit Cat No.10911 試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；引物合成，基因測序由金唯智生物科技有限公司完成。

1.1.3 引物列表

結(jié)果見表1。

表1 引物列表Table 1 Primer list

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒pMY-PGK1構(gòu)建

以質(zhì)粒YEp352-PAK為模板，利用表1中引物cut-PGK1-F 和cut-PGK1-R 擴增啟動子PGK1。以質(zhì)粒pMY 為模板，利用表1 中引物cut-GAP-F 和cut-GAP-R，PCR 擴增質(zhì)粒pMY 部分片段作為載體。片段純化后，使用One Step Cloning 試劑盒連接載體和片段。克隆過程如圖1所示。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入JM109 感受態(tài)細胞，挑取單克隆于篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒pMY-PGK1，利用引物cut-gRNA-F 和cut-gRNAR作PCR擴增并測序驗證。

1.2.2 sgRNA 寡核苷酸雙鏈序列設(shè)計

分別對S. cerevisiae基因組中TRP1 基因（NC_001136.10）和S. eubayanus基因組中TRP1基因（NC_030979.1）作sgRNA 靶點選擇及序列設(shè)計（https://chopchop.cbu.uib.no/），基因序列參考NCBI 中S.cerevisiaeS288C 和S.eubayanus基因組中TRP1 基因序列。由此得到TRP1-SC-sgRNA 和TRP1-SEsgRNA兩種寡核苷酸雙鏈，具體序列見表2。

圖1 質(zhì)粒pMY-PGK1構(gòu)建過程Fig.1 Plasmid pMY-PGK1 construction

表2 S.cerevisiae 和S.eubayanusTRP1基因sgRNATable 2 sgRNA for TRP1 gene of S.cerevisiae and S.eubayanus

1.2.3 質(zhì)粒pMY-TRP1-SC，pMY-TRP1-SE，pMYPGK1-TRP1-SC和pMY-PGK1-TRP1-SE構(gòu)建

設(shè)計引物SC1-20D-F 和SC1-20D-R，SE1-20D-F 和SE1-20D-R（見表1），引物中包含TRP1基因sgRNA，以質(zhì)粒pMY 和pMY-PGK1 為模板PCR 擴增該質(zhì)粒中部分片段，分別在E.coli JM109中表達，分別挑取單克隆，提取已修改sgRNA 序列（分別為TRP1-SC-sgRNA 和TRP1-SE-sgRNA）質(zhì)粒pMY 和pMY-PGK1 并驗證。由于質(zhì)粒pMY 和pMY-PGK1 中錘頭狀核酶（Hammerhead ribozyme，HH）結(jié)構(gòu)5'端前6 個核苷酸序列與sgRNA 中5'端前6個核苷酸序列呈回文結(jié)構(gòu)，因此同樣方法修改質(zhì)粒pMY和pMY-PGK1中HH核酶結(jié)構(gòu)中5'端前6個核苷酸序列，引物均為SC1-6D-F 和SC1-20D-R，SE1-6D-F 和SE1-6D-R 見表1。由此構(gòu)建質(zhì)粒pMY- TRP1-SC，pMY- TRP1-SE，pMY-PGK1-TRP1-SC和pMY-PGK1-TRP1-SE。

1.2.4 質(zhì) 粒pMY- Cas9- TRP1- SC， pMY- Cas9-TRP1-SE，pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SC 和pMYPGK1-Cas9-TRP1-SE構(gòu)建

分別以質(zhì)粒pMY-TRP1-SC，pMY-TRP1-SE，pMY-PGK1-TRP1-SC 和pMY-PGK1-TRP1-SE 為模板，均以G-PGK1-pMY-F 和G-PGK1-pMY-R 為引物，擴增pMY-TRP1-SC，pMYTRP1-SE，pMY-PGK1-TRP1-SC 和pMY-PGK1-TRP1-SE 部分片段。以質(zhì)粒pRCC-K 為模板，GCas9-F和G-Cas9-R為引物，擴增pRCC-K部分片段為載體。片段純化后，使用One Step Cloning 試劑盒分別連接。pMY-Cas9-TRP1-SC 和pMYCas9-TRP1-SE 構(gòu)建過程如圖2A 所示，pMYPGK1-Cas9-TRP1-SC 和pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SE 構(gòu)建過程如圖2B 所示。重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入E.coli JM109 感受態(tài)細胞，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒并對重組質(zhì)粒作測序驗證。

圖2 質(zhì)粒pMY-Cas9-TRP1-SC，pMY-Cas9-TRP1-SE，pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SC和pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SE構(gòu)建過程Fig.2 Construction process of plasmids pMY-Cas9-TRP1-SC,pMY-Cas9-TRP1-SE,pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SC and pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SE

1.2.5 TRP1敲除菌株構(gòu)建

以表1中引物TRP1-SC-TONG-F和TRP1-SCTONG-R，TRP1-SE-TONG-F 和TRP1-SE-TONGR 互為模板，PCR 擴增長度為100 bp TRP1 修復DNA TRP1-SC 和TRP1-SE，將質(zhì)粒pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SC、pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SE、修復DNA TRP1-SC 和TRP1-SE 電轉(zhuǎn)化入啤酒酵母Pilsner 感受態(tài)細胞。再以同樣方法，將質(zhì)粒pMYCas9-TRP1-SC、pMY-Cas9-TRP1-SE、修復DNA TRP1-SC 和TRP1-SE 電轉(zhuǎn)化入啤酒酵母Pilsner 感受態(tài)細胞。斷裂DNA 雙鏈作同源重組修復。28 ℃培養(yǎng)2 d，分別挑取轉(zhuǎn)化子，均以TRP1-SC-F 和TRP1-SC-R、TRP1-SE-F 和TRP1-SE-R 為引物，作菌落PCR驗證基因TRP1敲除。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒pMY-Cas9-TRP1-SC，pMY-Cas9-TRP1-SE，pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SC和pMYPGK1-Cas9-TRP1-SE構(gòu)建

pMY 和YEp352-PAK 質(zhì) 粒，PCR 擴增 相 應片段后利用無縫克隆技術(shù)連接，重組質(zhì)粒命名為pMY-PGK1。PCR 擴增質(zhì)粒pMY-PGK1 中g(shù)RNA 和PGK1啟動子片段并測序驗證。

質(zhì)粒pMY 和pMY-PGK1 均兩次PCR 擴增，點突變修改質(zhì)粒中sgRNA序列和質(zhì)粒中HH核酶結(jié)構(gòu)5'端前6 個核苷酸與sgRNA 回文序列。測序驗證，結(jié)果表明質(zhì)粒pMY-TRP1-SC、pMY-TRP1-SE、pMY-PGK1-TRP1-SC 和pMY-PGK1-TRP1-SE 構(gòu)建成功。

擴增質(zhì)粒pRCC-K 相應片段，質(zhì)粒pMYTRP1-SC、pMY-TRP1-SE、pMY-PGK1-TRP1-SC和pMY-PGK1-TRP1-SE PCR擴增相應片段，利用無縫克隆技術(shù)連接成質(zhì)粒pMY-Cas9-TRP1-SC，pMY-Cas9-TRP1-SE，pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SC和pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SE。

2.2 pMY-Cas9-TRP1-SC和pMY-Cas9-TRP1-SE未能成功敲除基因TRP1

將構(gòu)建成功質(zhì)粒pMY-Cas9-TRP1-SC、pMYCas9-TRP1-SE 和目的基因TRP1 修復DNA TRP1-SC、DNA TRP1-SE 電轉(zhuǎn)化入啤酒酵母Pilsner 感受態(tài)細胞，電轉(zhuǎn)化入啤酒酵母Pilsner 感受態(tài)細胞，分別挑取單克隆作PCR驗證。

如圖3 所示，利用質(zhì)粒pMY-Cas9-TRP1-SC、pMY-Cas9-TRP1-SE未能成功敲除基因TRP1，轉(zhuǎn)化子Pilsner-trp1和原始菌株P(guān)ilsner中擴增S.cerevisiae和S.eubayanus基因組中TRP1均為792和782 bp。

圖3 基因TRP1未敲除驗證電泳Fig.3 Electrophoresis of gene TRP1 not knockout verification

2.3 質(zhì)粒pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SC 和pMYPGK1-Cas9-TRP1-SE成功敲除基因TRP1

將構(gòu)建成功質(zhì)粒pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SC、pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SE 和TRP1 修 復DNA TRP1-SC、DNA TRP1-SE 電轉(zhuǎn)化入啤酒酵母Pilsner感受態(tài)細胞，電轉(zhuǎn)化入啤酒酵母Pilsner感受態(tài)細胞，分別挑取單克隆作PCR驗證。

如圖4 所示，利用質(zhì)粒pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SC、pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SE 成功敲除基因TRP1，重組菌命名為Δtrp1。利用Δtrp1 擴增S.cerevisiae和S.eubayanus基因組中基因TRP1長度分別為117和107 bp，而原始菌株P(guān)ilsner 中擴增S.cerevisiae和S.eubayanus基因組中TRP1長度分別792和782 bp。因此，質(zhì)粒pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SC、pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SE 可敲除Lager 酵母Pilsner中基因。

圖4 基因TRP1敲除驗證電泳Fig.4 Electrophoresis of gene TRP1 knockout verification

3 討論與結(jié)論

CRISPR-Cas9 系統(tǒng)是定向基因編輯的關(guān)鍵技術(shù)，可提高基因編輯效率，成本低廉、操作過程簡單便捷。CRISPR-Cas9 系統(tǒng)在真菌中應用廣泛，2013 年Dicarlo 等將CRISPR-Cas9 技術(shù)應用于S.cerevisiae[20]，單鏈和雙鏈靶基因斷裂效率大幅提升，Bao等將CRISPR-Cas9系統(tǒng)成功應用于S.cerevisiae中多基因敲除[21]。在啤酒工業(yè)中，Ale型啤酒酵母（S. cerevisiae）和Lager 型啤酒酵母（S. pastorianus）為典型菌株，而CRISPR-Cas9 系統(tǒng)在S.cerevisiae中應用成熟，但在Lager 型啤酒酵母中鮮有研究。Lager 型啤酒酵母由S.cerevisiae與S.eubayanus雜交，來源于S.eubayanus基因賦予啤酒酵母優(yōu)良耐低溫性能[22]。由于其染色體為雜倍體，一個基因常有多個等位基因，因此成為CRISPR-Cas9 系統(tǒng)在Lager型啤酒酵母中應用難點之一。在Lager型啤酒酵母基因功能研究中，使用經(jīng)典同源重組技術(shù)無法將基因全部拷貝完全敲除，而利用CRISPRCas9 作目的基因敲除可將菌株中單個基因多個拷貝完全敲除，提高敲除效率。

本研究構(gòu)建針對S.pastorianusCRISPR-Cas9 系統(tǒng)，通過帶有特異性靶序列g(shù)RNA 引導Cas9 蛋白，對靶序列精準切割，產(chǎn)生DNA 雙鏈斷裂（Double strains break, DSB），再由修復DNA 與產(chǎn)生DSB 部位同源重組，實現(xiàn)基因定向改造。本試驗采用TRP1 報告基因在S. pastorianus菌株P(guān)ilsner 中有兩種不同序列，分別為TRP1-SC 和TRP1-SE，同源性為67.5%。因此在設(shè)計sgRNA時，無法在同源區(qū)找到合適sgRNA，需分別設(shè)計定位到基因TRP1 兩種序列sgRNA和兩種TRP1序列修復DNA。

質(zhì)粒pRCC-K 通用于S.cerevisiaeCRISPR-Cas9系統(tǒng)質(zhì)粒[23]，但不適用S. pastorianus目的基因敲除，該質(zhì)粒導入目的菌株無法敲除目的基因（數(shù)據(jù)未顯示）。推測是由于pRCC-K中SNR52為RNA聚合酶Ⅲ啟動子，使RNA 聚合酶Ⅲ表達水平較低，不足以使Cas9蛋白切割靶向位點形成DSB[24]。因此為確保質(zhì)粒中Cas9 基因高效表達，本試驗將質(zhì)粒pMY- Cas9- TRP1- SC、 pMY- Cas9- TRP1- SE、pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SC 和pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SE 中g(shù)RNA 啟動子替換為RNA 聚合酶Ⅱ啟動子。RNA 聚合酶Ⅱ啟動子直接轉(zhuǎn)錄sgRNA 會在5'和3'端形成多余結(jié)構(gòu)，降低其活性，需在5'和3'端添加錘頭狀核酶和肝炎三角洲病毒核酶（Hepatitis delta virus ribozyme，HDV）識別位點序列。HH核酶和HDV 核酶用于介導特異性分子內(nèi)裂解，確保質(zhì)粒中啟動子活性。HH 核酶結(jié)構(gòu)5'端前6 個核苷酸與sgRNA 5'端前6個核苷酸互補形成莖環(huán)，作為HH核酶自切割位點。因此，在HH核酶和HDV核酶轉(zhuǎn)錄和自切割后，質(zhì)粒中可產(chǎn)生活性sgRNA。

GAP是畢赤酵母（Pichia pastoris）表達外源蛋白質(zhì)常用組成型啟動子。Waterham 等首次成功分離GAP啟動子，利用該啟動子構(gòu)建多種外源蛋白表達體系，表達周期短，表達效率高[25]。但GAP啟動子表達系統(tǒng)多應用于P.pastoris，較少應用于S.cerevisiae或S. pastorianus。本研究使用GAP 啟動子質(zhì)粒pMY-Cas9-TRP1-SC 和pMY-Cas9-TRP1-SE，未能成功將S.pastorianus中靶基因TRP1 敲除。而位于S.cerevisiae 染色體Ⅲ上PGK1 是S.cerevisiae基因編輯中常用強啟動子，因此選擇PGK1啟動子替換原有GAP 啟動子。使用PGK1 啟動子質(zhì)粒pMYPGK1-Cas9-TRP1-SC 和pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SE 成功將S. pastorianus中靶基因TRP1 敲除?？芍^GAP啟動子，來源于S. cerevisiae PGK1啟動子更適合在S.pastorianus中啟動基因表達。

Lager 酵母染色體雜倍特性使其基因編輯技術(shù)更新緩慢，不利Lager 酵母中非釀酒酵母基因功能研究。Lager 酵母中CRISPR-Cas9 技術(shù)成熟應用，促進Lager 酵母中不同來源基因功能研究。本研究建立適用于Lager 酵母基因編輯CRISPR-Cas9 系統(tǒng)，通過質(zhì)粒pMY-PGK1-Cas9-TRP1-SC、pMYPGK1-Cas9-TRP1-SE 和修復DNA 可敲除目的基因，但該系統(tǒng)基因敲除成功率提高與其在不同Lager酵母菌株中應用有待深入研究。