張艷菊，劉齊月，張 笛，陶 磊，王春龍，劉行風(fēng)，李雪蓮，馬 天，劉 東

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

黃瓜棒孢葉斑病又稱褐斑病、靶斑病。1906年首次在歐洲發(fā)現(xiàn)[1]，目前中國(guó)[2]、美國(guó)[3]、日本[4]、韓國(guó)[5]等地均有發(fā)生和報(bào)道。近年來(lái)黃瓜棒孢葉斑病在我國(guó)黃瓜種植區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，成為黃瓜生產(chǎn)主要病害之一[6]。黃瓜棒孢葉斑病一般在田間葉片發(fā)病率為10%～25%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)70%甚至100%[7]。黃瓜棒孢葉斑病菌侵染破壞力強(qiáng)、極易變異，防治難度超過(guò)黃瓜霜霉病，已由次要病害上升至世界主要病害[8]。當(dāng)前黃瓜棒孢葉斑病在黑龍江地區(qū)黃瓜保護(hù)地生產(chǎn)中十分常見，危害較重。

引起黃瓜棒孢葉斑病病原菌為多主棒孢[Corynesporacassiicola（Berk &Curt）Wei]，屬于絲孢綱（Hyphomycetes）暗色菌科（Dematiaceae）棒孢屬（Corynespora）真菌，1950 年統(tǒng)一定名為Corynespora cassiicola[9]。該病以危害葉片為主，根據(jù)不同溫濕度條件，葉部病斑分為3 種類型：小型斑、大型斑、多角型斑[10]。由于易于流行、發(fā)病范圍廣、危害重且該病癥狀易與黃瓜霜霉病、黃瓜細(xì)菌性角斑病及黃瓜炭疽病混淆，因此建立準(zhǔn)確、快速、靈敏、實(shí)用的黃瓜棒孢葉斑病菌檢測(cè)方法及早期監(jiān)測(cè)非常必要。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物病原真菌、細(xì)菌、病毒等多方面檢測(cè)。在黃瓜棒孢葉斑病菌應(yīng)用方面，孫炳學(xué)等建立一種快速、高效、定量檢測(cè)黃瓜多主棒孢（Corynespora cassiicola）琥珀酸脫氫酶B 亞基（SdhB）H278R 突變的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（AS-real-time PCR）檢測(cè)方法[11]。高葦?shù)仍O(shè)計(jì)一種檢測(cè)土壤中黃瓜棒孢葉斑病菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法[12]，但其試驗(yàn)?zāi)０鍨橥寥?，操作繁雜，難度大、成本高，且黃瓜棒孢葉斑病為氣傳病害[13]，建立葉片病菌檢測(cè)方法更適用于生產(chǎn)中病害的檢測(cè)與預(yù)測(cè)。

本試驗(yàn)旨在設(shè)計(jì)一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法，在侵染黃瓜葉片早期檢測(cè)黃瓜棒孢葉斑病菌，為黃瓜棒孢葉斑病預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)和監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及菌株DNA提取

供試菌株：來(lái)自黑龍江省不同地區(qū)的5個(gè)黃瓜棒孢葉斑病菌株及7個(gè)黃瓜其他病害致病菌。黃瓜棒孢葉斑病菌（Corynespora cassiicola）為采集于黑龍江省并已鑒定的菌株，黃瓜霜霉病菌（Pseudoperonospora cubensis）及黃瓜白粉病菌（Sphaerothecacu curbitae）采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)站。黃瓜角斑病菌（Pseudomonas syringae）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、黃瓜黑斑病菌（Alternaria cucumerina）、黃瓜黑星病菌（Cladosporium cucumerinum）及黃瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理研究室提供（見表1）。

供試作物品種：黃瓜（Cucumis sativusL.）感病品系D0401由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與園林學(xué)院黃瓜課題組提供。

表1 供試菌株名稱和來(lái)源Table 1 Codes and origin of the isolates used in this study

黃瓜棒孢葉斑病菌（C.cassiicola）、黃瓜黑斑病菌（A.cucumerina）、黃瓜黑星病菌（C.cucumerinum）、黃瓜炭疽病菌（C.orbiculare）培養(yǎng)于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板；黃瓜枯萎病菌（F.oxysporum）培養(yǎng)于馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）平板；黃瓜霜霉病菌（P.cubensis）、黃瓜白粉病菌（S.cucurbitae）收集于新鮮黃瓜葉片；黃瓜角斑病菌（P.syringae）置于28 ℃King B培養(yǎng)基中120 r·min-1搖動(dòng)生長(zhǎng)。收集培養(yǎng)后菌株，利用CTAB 法提取供試真菌及卵菌基因組DNA[14]，細(xì)菌基因組DNA采用改良CTAB法提取[15]。

1.2 特異性引物設(shè)計(jì)與驗(yàn)證

參考Wu等列舉黃瓜棒孢葉斑病菌保守肌動(dòng)蛋白序列actin[16]，選定黃瓜棒孢葉斑病菌actin 參考序列（GenBank:MH511656.1）及其他供試病原菌actin 序 列（GenBank： HM148567； KF178566；JQ965663；JQ671742.1），利用DNAMAN 軟件比對(duì)，Primier 6.0軟件設(shè)計(jì)10對(duì)特異性引物，引物序列見表2，由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司合成，使用時(shí)將引物用ddH2O稀釋至10 μmol·L-1。

將上述引物分別以供試菌株基因組DNA（10 ng·μL-1）為模板作普通PCR擴(kuò)增，檢測(cè)該引物對(duì)黃瓜棒孢葉斑病菌是否存在特異性。普通PCR反應(yīng)體系為（25 μL）：Premix Taq?12.5 μL、上下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL、模板DNA（10 ng·μL-1）1 μL 和ddH2O 10.5 μL。陰性對(duì)照無(wú)DNA。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。利用EPS-600 型電泳儀，Jel Doc 2001型凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD，美國(guó)），1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品制備

標(biāo)準(zhǔn)品為提純的目的基因片段，用于制作實(shí)時(shí)熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線。普通PCR 反應(yīng)體系為（50 μL）：Premix Taq ?25 μL、上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL、黃瓜棒孢葉斑病菌基因組DNA（10 ng·μL-1）2 μL 和ddH2O 21μL；擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。制備1%含EB 瓊脂糖凝膠，取4 μL PCR產(chǎn)物，各加入2 μL 溴酚蘭溶液，用DL2000 DNA Marker作對(duì)照，恒壓電泳30 min，全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收（南京維諾贊生物技術(shù)有限公司），回收產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否存在目的基因條帶，若條帶存在則將膠回收產(chǎn)物送吉林庫(kù)美生物有限責(zé)任公司測(cè)序。

1.4 黃瓜棒孢葉斑菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系建立與優(yōu)化

1.4.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

本文將層次分析的方法應(yīng)用在礦井設(shè)計(jì)方案中，初步嘗試決策方法，應(yīng)用的結(jié)果證明，層次分析的方法非常簡(jiǎn)單實(shí)用，具有系統(tǒng)性、邏輯性和靈活性，在采礦領(lǐng)域里，除了選擇礦井設(shè)計(jì)方案之外，還可以進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化、采礦方案優(yōu)化等，各類資源的設(shè)計(jì)、分配都可以實(shí)用層次分析法進(jìn)行判斷和處理。

為建立適合黃瓜棒孢葉斑病菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系，優(yōu)化退火溫度、模板濃度及引物濃度。

①退火溫度：將退火溫度設(shè)置為57、58、60、62 ℃4個(gè)退火溫度。

②模板濃度：根據(jù)不同濃度模板DNA 對(duì)產(chǎn)物擴(kuò)增效率及反應(yīng)熒光吸收強(qiáng)度的影響，設(shè)置模板含量為1、2、3 μL（10 ng·μL-1），確定合適體系DNA模板濃度。

③引物濃度：根據(jù)反應(yīng)熔解曲線和產(chǎn)物擴(kuò)增效率，將引物含量設(shè)置為0.2、0.3、0.4 μL（10 μmol·L-1)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系為（20 μL）：10 μL Taq SYBR?Green qPCR Premix，0.2～0.4 μL 上下游混合引物（10 μmol·L-1），1～3 μL（10 ng·μL-1）模板DNA，ddH2O 補(bǔ)齊至20 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性10 s，52～58 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.4.2 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

將標(biāo)準(zhǔn)品10 倍梯度稀釋，得到濃度梯度依次為1.36×101～1.36×10-7ng·μL-1模板DNA。每個(gè)濃度3 次重復(fù)，空白對(duì)照為滅菌ddH2O。利用已篩選反應(yīng)程序及反應(yīng)體系作實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以起始濃度對(duì)數(shù)值為X 軸，以Cq 值為Y 軸構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線由實(shí)時(shí)熒光定量PCR軟件自動(dòng)生成。

1.4.3 靈敏度與重復(fù)性試驗(yàn)

將10 倍梯度稀釋的黃瓜棒孢葉斑病菌標(biāo)準(zhǔn)品作為模板作實(shí)時(shí)熒光定量PCR，確定該體系檢測(cè)黃瓜棒孢葉斑病菌最小濃度。

將3個(gè)稀釋濃度標(biāo)準(zhǔn)品作批次內(nèi)和批次間重復(fù)性試驗(yàn)，驗(yàn)證該檢測(cè)方法穩(wěn)定性。批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)可對(duì)同一樣品同時(shí)測(cè)定3次重復(fù)，批間重復(fù)可在不同時(shí)間對(duì)同一樣品模板測(cè)定3次重復(fù)。SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算Cq值，得到相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差SD及變異系數(shù)CV，變異系數(shù)CV 小于2%時(shí)，認(rèn)為該反應(yīng)體系重復(fù)性與穩(wěn)定性良好。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 定量檢測(cè)黃瓜葉片棒孢葉斑病菌潛伏侵染量動(dòng)態(tài)變化

1.5.1 供試菌株及作物

供試菌株：黃瓜棒孢葉斑病菌（Corynespora cassiicola），采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)站。供試作物品種：黃瓜高抗品種D9320（HR）、抗病品種美國(guó)小黃瓜（R）、中抗品種北京301（MR）、感病品種D805（S）、高感品種D0401（HS），由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黃瓜課題組提供。

1.5.2 育苗及接種

將5 個(gè)不同品種黃瓜種子播種于育苗穴盤中，7 d 后子葉展平時(shí)將幼苗移入營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)，每缽留1株。白天25 ℃，夜晚15 ℃正常管理。待黃瓜第1片真葉展平時(shí)取下，將真葉打成直徑20 mm 葉盤。配制濃度為1×105個(gè)·mL-1黃瓜棒孢葉斑病菌孢子懸浮液，每個(gè)葉盤接種3滴濃度1×105個(gè)孢子·mL-1菌懸液，每滴10 μL，每個(gè)處理15 個(gè)葉盤，3 次重復(fù)，接種ddH2O設(shè)為對(duì)照，接菌后注意保濕避光。

1.5.3 采集樣品并調(diào)查病情指數(shù)

接種2、4、8、12、24、36、48、96 和120 h后各取樣1次，每次不同品種各采集3個(gè)葉盤，3次重復(fù)。清水反復(fù)沖洗后置于離心管中備用。同時(shí)調(diào)查發(fā)病情況。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為[17]：0級(jí)：無(wú)病癥；1級(jí)：病斑面積占葉面積5%以下；2級(jí)：病斑面積占葉盤面積5%～25%；3 級(jí)：病斑面積占葉盤面積25%～50%；4級(jí)：病斑面積占葉盤面積50%以上。

1.5.4 提取樣品DNA并檢測(cè)侵染量

將收集的葉盤剪碎，混勻，稱取0.1 g，利用CTAB法提取黃瓜葉片基因組DNA。以得到的基因組DNA 為模板，應(yīng)用已優(yōu)化的實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系檢測(cè)黃瓜棒孢葉斑病菌侵染黃瓜葉片侵染量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每個(gè)時(shí)段黃瓜葉片內(nèi)棒孢葉斑病菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜棒孢葉斑病菌引物特異性檢測(cè)

提取供試菌株基因組DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1 所示。病原菌DNA 條帶清晰明亮，提取的DNA 具有較高濃度和純度，可用作底物模板以滿足下一步試驗(yàn)要求。

表2為10對(duì)引物特異性檢測(cè)結(jié)果，“+”表示瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)有條帶，“-”表示瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)無(wú)條帶，結(jié)果顯示引物CAF2/CAR2 對(duì)黃瓜棒孢葉斑病菌具有良好特異性。

引 物CAF2（5'GCCTCGAGCTGTTTTCCGTAAG T3'）/CAR2（5'CCGATCATGATACTGGCAGT GGTC3'）擴(kuò)增的來(lái)自不同地區(qū)黃瓜棒孢葉斑病菌和其他黃瓜病原菌瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。可見僅黃瓜棒孢葉斑病菌擴(kuò)增出186 bp 特異性條帶，而其他黃瓜病害病原菌無(wú)條帶，表明引物CAF2/CAR2 可用作黃瓜棒孢葉斑病菌特異性引物。

圖1 病原菌DNA檢測(cè)電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of pathogen DNA

表2 引物特異性檢測(cè)結(jié)果Table 2 Primer pairs used in this study and the specific test result

圖2 引物CAF2/CAR2對(duì)黃瓜棒孢葉斑病菌特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Specific detection results of cucumber target leaf spot by primer CAF2/CAR2

2.2 目的基因鑒定

將膠回收純化后（見圖3）目的基因產(chǎn)物送至吉林庫(kù)美生物有限責(zé)任公司測(cè)序。結(jié)果表明，CAF2/CAR2 擴(kuò)增出的黃瓜棒孢葉斑病菌目的基因?yàn)?86 bp。

圖3 膠回收電泳結(jié)果Fig.3 Gel recovery product detection electropherogram

其序列如下：CTTAACCGTAAACTATGCCGA CTAGGGATCGGGCGATGTTTCTATCTTGACTCGCT CGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCT GGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAG AAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCC TGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAA。

2.3 黃瓜棒孢葉斑病菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR 體系建立與優(yōu)化

2.3.1 退火溫度

3 種濃度模板在退火溫度為57、58、60 和62 ℃下平均Cq 值和熒光信號(hào)強(qiáng)度見表3?？梢姡０鍧舛认嗤瑫r(shí)，退火溫度60 ℃，Cq 值最小，對(duì)應(yīng)熒光信號(hào)強(qiáng)度最強(qiáng)，表明該反應(yīng)在60 ℃時(shí)具有較高擴(kuò)增效率。而在其他退火溫度下，反應(yīng)擴(kuò)增效率低、不穩(wěn)定。因此，當(dāng)退火溫度為60 ℃時(shí)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)最穩(wěn)定。

2.3.2 模板濃度

將黃瓜棒孢葉斑病菌DNA 模板分別以1、2 和3 μL（10 μmol·L-1）添加至反應(yīng)體系，根據(jù)熔解曲線穩(wěn)定性確定合適的DNA 模板濃度，如圖4 所示。當(dāng)模板加入量為3 μL 時(shí)，曲線總體穩(wěn)定，加入量為1或2 μL時(shí)，熔解曲線與3μL濃度相比，表達(dá)不穩(wěn)定。因此，當(dāng)檢測(cè)系統(tǒng)中DNA 模板量為3μL時(shí)，更有利于樣品基因表達(dá)。

表3 不同退火溫度下實(shí)時(shí)熒光定量PCR Cq值和熒光強(qiáng)度Table 3 Cq value and intensity of fluorescence signal in different annealing temperature

圖4 不同DNA濃度熔解曲線Fig.4 Melting curves of different DNA concentrations

2.3.3 引物濃度

引物以0.2、0.3 和0.4 μL（10 μmol·L-1）添加到反應(yīng)系統(tǒng)中時(shí)，可根據(jù)熔解曲線確定適合引物量（見圖5）。

由圖5 可知，當(dāng)體系中引物量為0.2 μL（10 μmol·L-1）時(shí)，熔解曲線表達(dá)最穩(wěn)定。當(dāng)引物添加量為0.3 或0.4 μL 時(shí)，反應(yīng)熔解曲線明顯不一致，且曲線導(dǎo)數(shù)不同。當(dāng)引物添加0.2 μL 時(shí)，熔解曲線顯示相同趨勢(shì)，反應(yīng)過(guò)程更穩(wěn)定。因此，體系中引物最適添加量為0.2 μL（10 μmol·L-1）。

圖5 不同引物濃度熔解曲線Fig.5 Melting curves of different primer concentrations

2.4 黃瓜棒孢葉斑病菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

應(yīng)用上述優(yōu)化實(shí)時(shí)熒光定量PCR 體系，對(duì)濃度梯度為1.36×101～1.36×10-7ng·μL-1標(biāo)準(zhǔn)品作實(shí)時(shí)熒光定量PCR 處理，獲得各自Cq 值（見表4），標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6。由于1.36×101～1.36×10-7ng·μL-1間濃度拷貝數(shù)與其對(duì)應(yīng)Cq值具有良好線性關(guān)系，因此選擇此濃度梯度為模板。標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2為0.995（>0.95），斜率為-3.54（-3.58～-3.10），擴(kuò)增效率為108.23%（90%～110%）。標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為y=28.06-3.54x。

表4 濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)Cq值Table 4 Cq value of concentration gradient standard DNA

圖6 黃瓜棒孢葉斑病菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of Corynespora cassiicola using real-timefluorescence quantitativePCR

2.5 黃瓜棒孢葉斑病菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR 靈敏度、穩(wěn)定性和可重復(fù)性檢驗(yàn)

選擇1.36×10-1～1.36×10-7ng·μL-110 倍濃度梯度的7 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品作實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)（如圖7 所示），檢測(cè)到標(biāo)準(zhǔn)品DNA 最小濃度為1.36×10-6ng·μL-1。

為驗(yàn)證該體系可重復(fù)性和穩(wěn)定性，測(cè)試3個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品批次內(nèi)和批次間重復(fù)性。表5所示為反應(yīng)Cq 值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，其中組內(nèi)和組間重復(fù)變異系數(shù)均小于2%，說(shuō)明該體系具有良好的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。

圖7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏感度檢測(cè)Fig.7 Sensitivity detection of primers by real-time fluorescence quantitative PCR

表5 黃瓜棒孢葉斑病菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系穩(wěn)定性檢測(cè)Table 5 Stability detection of real-time fluorescence quantitative PCR system for Corynespora cassiicola

2.6 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)黃瓜葉片中棒孢葉斑病菌潛伏侵染量動(dòng)態(tài)變化

2.6.1 黃瓜接種后發(fā)病情況

黃瓜棒孢葉斑病菌點(diǎn)滴接種黃瓜真葉葉盤后，將溫度控制在17～25 ℃，相對(duì)濕度80%以上，參考黃瓜棒孢葉斑病菌病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[17]，發(fā)病癥狀及病情級(jí)別如圖8 所示，其中A 表示0 級(jí)發(fā)病植株葉片癥狀；B表示1級(jí)發(fā)病植株葉片癥狀；C表示2級(jí)發(fā)病植株葉片癥狀；D表示3級(jí)發(fā)病植株葉片癥狀；E表示4級(jí)發(fā)病植株葉片癥狀。

圖8 黃瓜棒孢葉斑病不同級(jí)別發(fā)病癥狀Fig.8 Symptoms of cucumber target leaf spot with different disease level

2.6.2 接種后不同時(shí)間黃瓜葉片病情級(jí)別及葉片帶菌量

表6為黃瓜棒孢葉斑病菌接種5種不同抗性黃瓜真葉葉盤后病情級(jí)別及病菌在植物組織內(nèi)潛伏侵染量Cq值變化及病菌濃度。Cq值大于30表示病菌未侵染黃瓜葉片，可將此部分忽略不計(jì)。病情級(jí)別調(diào)查結(jié)果說(shuō)明不同抗性黃瓜品種潛伏期表現(xiàn)不同，對(duì)于高抗品種，黃瓜棒孢葉斑病菌潛伏期最長(zhǎng)，為96 h；抗性品種與中抗品種病菌潛伏期為48 h；感病品種與高感品種病菌潛伏期為24 與12 h。而Cq 值反映黃瓜棒孢葉斑病菌真正開始侵染黃瓜葉片時(shí)間：對(duì)于高抗品種、抗性品種、中抗品種，黃瓜棒孢葉斑病菌侵染時(shí)間為接種后8 h，對(duì)于感病品種與高感品種，接種后4 h 即可檢出。由此可見，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)可在黃瓜葉片外觀無(wú)任何癥狀時(shí)即檢測(cè)到黃瓜棒孢葉斑病菌存在，證明其快速靈敏的特點(diǎn)，也為不同抗性黃瓜品種防治時(shí)間選擇提供理論依據(jù)。表6 還可看出，未接種黃瓜葉片CK 無(wú)Cq 值，說(shuō)明寄主DNA 不影響病菌檢測(cè)。

表6 接種后不同時(shí)間黃瓜葉片病情級(jí)別及葉片帶菌量Table 6 Disease level and amount of Corynespora cassiicola in cucumber leaves at different times after inoculation

3 討論與結(jié)論

黃瓜棒孢葉斑病是主要侵染黃瓜葉片、通過(guò)氣流傳播的病害。該病流行迅速且難以防治，癥狀又易與其他黃瓜病害混淆，特別是在早期階段，難以通過(guò)癥狀直接區(qū)分。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)可靈敏、特異地識(shí)別并量化空氣和植物中病原菌，因此本試驗(yàn)篩選出一對(duì)黃瓜棒孢葉斑病菌特異性引物CAF2/CAR2，該引物可區(qū)分黃瓜棒孢葉斑病菌與其他幾種在癥狀上易混淆的黃瓜致病菌。同時(shí)優(yōu)化實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)條件，建立黃瓜棒孢葉斑病菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法?？稍诓【秩驹缙诳焖?、準(zhǔn)確鑒定黃瓜棒孢葉斑病，還可用于監(jiān)測(cè)黃瓜棒孢葉斑病菌動(dòng)態(tài)變化，指導(dǎo)病害科學(xué)防治，防止病害爆發(fā)流行。

在實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法選擇上，本研究選用熒光染料SYBR GreenⅠ法，與Taq Man 探針?lè)ㄏ啾?，該方法可監(jiān)測(cè)任何dsDNA 序列擴(kuò)增，檢測(cè)方法較為簡(jiǎn)單，成本較低[18]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR有相對(duì)定量和絕對(duì)定量?jī)煞N，相對(duì)定量是在一定樣本中靶序列相對(duì)于另一參照樣本量的變化，即比較處理樣本和未處理樣本相對(duì)基因的表達(dá)差異[19]，而絕對(duì)定量是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣本拷貝數(shù)進(jìn)而對(duì)未知樣本定量。本研究并未涉及與另一參照樣本比較，因此明確葉片中黃瓜棒孢葉斑病菌侵染量及動(dòng)態(tài)變化，選擇絕對(duì)定量法更簡(jiǎn)潔快速，成本更低。

與已報(bào)道檢測(cè)土壤中黃瓜棒孢葉斑病菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系相比[12]，本體系更適用于黃瓜葉片中病菌檢測(cè)。以此檢測(cè)方法為基礎(chǔ)，可開展田間黃瓜棒孢葉斑病監(jiān)測(cè)與預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)工作，在田間僅需采集黃瓜葉片并作熒光定量PCR 檢測(cè)，即可明確黃瓜棒孢葉斑病菌有無(wú)及侵染量，為病害流行監(jiān)測(cè)提供依據(jù)。

黃瓜棒孢葉斑病菌人工接種通常采用葉片噴霧接種法[20]，難以控制接菌量，本研究需對(duì)葉片中病菌精確定量，因此選擇點(diǎn)滴接種法。與噴霧接種法相比，該方法保證每個(gè)葉盤接種菌量相同，保證后續(xù)定量檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。截止目前，葉盤發(fā)病病情分級(jí)尚無(wú)通用標(biāo)準(zhǔn)，本研究參考棒孢葉斑病通用分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[17]，將黃瓜葉片等比例縮放后判斷葉盤病情級(jí)別，黃瓜感病品種接種棒孢葉斑病菌至肉眼可觀察到病斑為24 h 左右，與Sharma[21]與Liu 等[22]研究結(jié)果相同。本研究建立實(shí)施熒光定量PCR 方法應(yīng)用于黃瓜葉片中棒孢葉斑病菌潛伏侵染量檢測(cè)，明確黃瓜棒孢葉斑病在5種不同抗性黃瓜品種上的侵染時(shí)間，結(jié)合栽培品種抗病性，在生產(chǎn)實(shí)踐中可為黃瓜棒孢葉斑病防治提供參考。