張祎 張莉 高燕 李海昌 范永升 謝志軍

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053 2.杭州市中醫(yī)院

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種系統(tǒng)性自身免疫病，它可引起皮膚、關(guān)節(jié)、漿膜、心臟、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)等多系統(tǒng)損害。皮膚損害是SLE患者第二常見的臨床表現(xiàn)，發(fā)生率為55%～85%[1]。據(jù)報(bào)道，28%的SLE患者皮膚損害出現(xiàn)早于其他系統(tǒng)損害[2]。SLE皮膚損害多表現(xiàn)為頰部紅斑、盤狀紅斑、亞急性皮膚型紅斑、光過敏及蕁麻疹等。西醫(yī)治療多采用糖皮質(zhì)激素霜?jiǎng)┗蜍浉嗤庥?，有一定療效，但長(zhǎng)期應(yīng)用易發(fā)生皮膚色素沉著等副作用；而中醫(yī)中藥具有多部位、多環(huán)節(jié)和多靶點(diǎn)的整體調(diào)節(jié)功能，治療SLE皮膚損害能夠提高療效、減少?gòu)?fù)發(fā)，并能改善患者預(yù)后。本文運(yùn)用一系列數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件對(duì)中醫(yī)藥治療SLE皮膚損害的處方進(jìn)行挖掘，運(yùn)用頻次分析、關(guān)聯(lián)規(guī)則、復(fù)雜系統(tǒng)熵聚類分析以探析中醫(yī)藥治療SLE皮膚損害的用藥規(guī)律，并運(yùn)用聚類分析、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）進(jìn)一步分析中藥治療SLE皮膚損害可能的機(jī)制，以對(duì)中藥治療療效和分子機(jī)制的相關(guān)性進(jìn)行驗(yàn)證，從而進(jìn)一步指導(dǎo)SLE皮膚損害的臨床用藥經(jīng)驗(yàn)。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 使用中國(guó)知網(wǎng)的高級(jí)檢索功能，選用主題檢索，檢索詞為“系統(tǒng)性紅斑狼瘡”或“SLE”，取兩者并集。文獻(xiàn)分類目錄選擇 “醫(yī)藥衛(wèi)生科技”欄目下的“中醫(yī)學(xué)”“中藥學(xué)”“中西醫(yī)結(jié)合”，時(shí)間從1979年1月1日到2019年3月14日，語言選擇中文，共檢索到文獻(xiàn)1 930篇。再將文獻(xiàn)逐一篩選，將涉及皮膚損害的方藥單獨(dú)整理，分別按照來源、方劑、方藥等依次錄入到Excel表格中。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）明確診斷為SLE，有皮膚損害，經(jīng)過治療后紅斑顯著減少；（2）采用內(nèi)服中藥治療，且方藥完整，劑量明確。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）非內(nèi)服中藥治療；（2）方藥不全，劑量不明確；（3）重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn)。

1.3 數(shù)據(jù)規(guī)范 參照中國(guó)中醫(yī)藥出版社第7版《中藥學(xué)》和2015版《中國(guó)藥典》對(duì)部分中藥名稱進(jìn)行規(guī)范。如生地、生地黃統(tǒng)一為生地黃，丹皮、牡丹皮統(tǒng)一為牡丹皮，夜交藤、首烏藤統(tǒng)一為首烏藤，山萸肉、山茱萸統(tǒng)一為山茱萸，烏賊骨、海螵蛸統(tǒng)一為海螵蛸，七葉一枝花、蚤休、重樓統(tǒng)一為重樓等。注意檢查核對(duì)，剔除沒有具體劑量以及重復(fù)的組方。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 SLE皮膚損害處方規(guī)律分析 雙人合作將核對(duì)無誤后的SLE皮膚損害的病案數(shù)據(jù)錄入中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)（V2.5）中，運(yùn)用頻次分析、關(guān)聯(lián)規(guī)則分析以及復(fù)雜系統(tǒng)熵聚類分析等方法得到SLE皮膚損害的中藥用藥頻次、性味歸經(jīng)、藥對(duì)組合，并歸納出新處方。

1.4.2 機(jī)制分析 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入生成的新處方藥物，限定口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%，類藥性（drug likeness，DL）＞0.18，篩選其中藥成分和靶點(diǎn)。在人類基因數(shù)據(jù)庫(kù) （Human gene database,GeneCards）、人類在線孟德爾遺傳（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）等數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出SLE的疾病靶點(diǎn)，將各個(gè)新處方組合的靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)取交集，得到疾病-新處方組合靶點(diǎn)。以R軟件進(jìn)行通路分析，再以Cytoscape等軟件進(jìn)行通路可視化。

2 結(jié)果

2.1 SLE皮膚損害用藥分析

2.1.1 用藥頻次分析 最終獲得276首處方，選取其中用藥頻次大于45的中藥，其中生地黃使用177次，頻次最高；牡丹皮、赤芍、甘草、當(dāng)歸、黃芪、白花蛇舌草、金銀花的用藥頻次均大于70。用藥頻次前20位的藥物見表1。

表1 用藥頻次分析

2.1.2 藥物性味及歸經(jīng)分析 276首處方所涉及的藥物中，寒性藥物使用頻次最高，溫性藥次之，熱性藥使用頻次最少；五味中甘味、苦味藥居多；藥物歸經(jīng)多歸肝心腎肺經(jīng)。見表2。

2.1.3 基于關(guān)聯(lián)規(guī)則的藥物組合用藥規(guī)律分析 在中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)（V2.5）的方劑分析模塊中進(jìn)行“組方規(guī)律”分析，設(shè)置支持度45，置信度0.9時(shí)，得出19對(duì)藥物組合模式。生地黃、牡丹皮組合出現(xiàn)118次，頻次最高；其次是生地黃、赤芍和牡丹皮、赤芍組合。生地黃、牡丹皮、赤芍三藥組合出現(xiàn)的頻次為68。見表3。設(shè)置不同支持度、置信度所得到的藥物組合網(wǎng)絡(luò)不同，但其核心藥物網(wǎng)絡(luò)不變。見圖1。

表2 藥物性味歸經(jīng)頻次分析

2.1.4 復(fù)雜系統(tǒng)熵聚類的組方規(guī)律分析 設(shè)置相關(guān)度8、懲罰度6，提取組合后得到核心藥物組合18組。見表4。相關(guān)度和懲罰度不變的情況下，得到9個(gè)新處方。見表5。新處方聚類展示見圖2。

2.2 新處方相關(guān)信號(hào)通路分析 將疾病-新處方靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析，取P＜0.01，共涉及相關(guān)通路81個(gè)。見圖3。A1區(qū)域是新處方1單獨(dú)涉及的通路，共18個(gè)；A2區(qū)域是新處方2單獨(dú)涉及的通路，共3個(gè)；A3區(qū)域是新處方4單獨(dú)涉及的通路，共1個(gè)；A4區(qū)域是新處方6單獨(dú)涉及的通路，共2個(gè)。在9個(gè)新處方涉及的相關(guān)通路中，B區(qū)域通路出現(xiàn)2次，C區(qū)域通路出現(xiàn)3次，D區(qū)域通路出現(xiàn)4次，E區(qū)域通路出現(xiàn)5次，F(xiàn)區(qū)域通路出現(xiàn)6次，G區(qū)域通路出現(xiàn)7次，H區(qū)域通路出現(xiàn)8次，I區(qū)域?yàn)?個(gè)新處方組合的共同通路，分別是鈣信號(hào)通路、環(huán)磷酸腺苷 （cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號(hào)通路、膽堿能突觸、缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號(hào)通路、白介素-17（interleukin-17，IL-17）信號(hào)通路、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase-protein kinase B/Akt，PI3K-PKB/Akt） 信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路。

表3 藥物組合用藥規(guī)律分析

圖1 常用藥物組合網(wǎng)絡(luò)展示

表4 核心藥物組合

表5 SLE皮膚損害新處方

圖2 新處方聚類展示

圖3 各新處方信號(hào)通路及相互關(guān)系

各新處方信號(hào)通路聚類分析見圖4。紅色部分表示新處方靶點(diǎn)在該通路富集，綠色則相反。新處方5和9聚為一類；新處方3、8、4、7、6共同聚為一類；新處方1和2各自聚為一類。

3 討論

SLE皮膚損害的西醫(yī)治療有其局限性，而中醫(yī)藥治療有減毒增效的優(yōu)勢(shì)，近年不少醫(yī)家在SLE皮膚損害的病機(jī)認(rèn)識(shí)和治療方面積累了較多經(jīng)驗(yàn)。中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)可以從頻次分析、關(guān)聯(lián)規(guī)則分析、熵聚類分析等方面挖掘中藥組方用藥規(guī)律，而生物信息學(xué)分析工具可以進(jìn)一步分析中藥組方的作用機(jī)制。本文對(duì)中醫(yī)藥治療SLE皮膚損害的處方進(jìn)行挖掘，分析其中的用藥規(guī)律和可能的作用機(jī)制，以期為SLE皮膚損害的臨床用藥提供依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，SLE皮膚損害用藥中生地黃、牡丹皮、赤芍、甘草、當(dāng)歸、黃芪、白花蛇舌草、金銀花等中藥使用頻次較高。生地黃清熱涼血、養(yǎng)陰生津；牡丹皮清熱涼血、活血化瘀；赤芍清熱涼血、散瘀止痛；白花蛇舌草清熱解毒、利濕通淋；金銀花清熱解毒、疏散風(fēng)熱，以上皆為清熱藥。另有黃芪補(bǔ)氣，當(dāng)歸補(bǔ)血，氣行則血行，血行則瘀去。使用頻次大于70的中藥有清有補(bǔ)，以清為主。文獻(xiàn)中有關(guān)SLE用藥規(guī)律的研究較多，例如賈超磊等[3]對(duì)CNKI中SLE的用藥情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，共納入64篇文獻(xiàn)，得出使用頻次超過50的主要有生地黃、牡丹皮、甘草、赤芍、茯苓、丹參、黃芪、當(dāng)歸、白術(shù)、玄參。王浩等[4]研究中藥防治SLE臨床用藥規(guī)律，得出累計(jì)頻率大于75%的有生地黃、牡丹皮、黃芪、甘草、丹參、茯苓、赤芍、玄參、當(dāng)歸、知母。鐘興華[5]基于文獻(xiàn)對(duì)SLE的中醫(yī)證治進(jìn)行探討，頻次較高的依次是生地黃、牡丹皮、茯苓、黃芪、白花蛇舌草、甘草、赤芍、山藥。對(duì)比分析可以看出，SLE皮膚損害的用藥規(guī)律與SLE總的用藥規(guī)律相似，其區(qū)別在于SLE皮膚損害的高頻用藥中有金銀花、連翹、紫草等?！队窬舅幗狻吩疲骸敖疸y花清散腫毒，治一切瘡瘍楊梅疥癬痔瘺痢疾之類，敷飲俱妙。”[6]癰瘡初起，紅腫熱痛者，可單用本品煎服，并用藥渣外敷患處。連翹辛涼透達(dá)，善治斑疹瘡瘍等皮膚病變，既能清心火、解瘡毒，又能消散癰腫結(jié)聚，所以被稱為“瘡家圣藥”。紫草清熱涼血，善解血分熱毒而透疹，可治血熱毒盛而出現(xiàn)的身熱口渴、疹欲出不出等。此三藥在皮膚損害方面效果明確，例如范永升教授治療SLE皮膚損害經(jīng)驗(yàn)是 “清熱于內(nèi)，散風(fēng)于外”，常用犀角地黃湯加連翹、防風(fēng)治療[7]。頓艷波等[8]對(duì)SLE皮膚病變進(jìn)行臨床觀察，有面部蝶形紅斑者加用金銀花、生地黃、紫草、玄參、黃芩，總有效率為95%。

藥物性味歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，寒性藥物使用頻次最多，SLE皮膚損害多屬于營(yíng)血分證，根據(jù)正治法的用藥原則，治以寒藥是顯而易見的。五味中甘味、苦味藥居多，甘可補(bǔ)益、苦可清泄，其功效符合清熱解毒的治則。肝藏血，心主血，血熱妄行，則發(fā)紅斑，故藥物多歸肝、心經(jīng)，疾病多從肝、從心論治。在藥物組合模式中，生地黃、牡丹皮組合頻次最高，生地黃、牡丹皮、赤芍也常常組合出現(xiàn)。前5對(duì)藥物組合所含中藥正合犀角地黃湯加減。犀角地黃湯處方包括犀角（現(xiàn)用水牛角代替）、生地黃、芍藥、牡丹皮。方中水牛角清心肝而解熱毒，直入血分而涼血；生地黃清熱涼血、養(yǎng)陰生津；赤芍與丹皮清熱涼血、活血化瘀，四藥合力，血運(yùn)熱清。任艷麗等[9]認(rèn)為，加味犀角地黃湯輔助治療皮膚型過敏性紫癜臨床效果較好，能顯著改善機(jī)體免疫功能。房定亞教授認(rèn)為SLE患者初期有發(fā)熱、面部紅斑等表現(xiàn)，此期中醫(yī)病因病機(jī)為血熱內(nèi)擾，迫血妄行，泛溢肌膚，治宜清熱涼血止血，犀角地黃湯加味[10]?！秱浼鼻Ы鹨健吩唬骸跋堑攸S湯，治傷寒及溫病應(yīng)發(fā)汗而不汗之內(nèi)蓄血者?！盵11]滋陰與清熱相輔相成，是其獨(dú)到之處。此外，趙婷等[12]提出，面部紅斑屬熱毒為患，瘀血阻滯，故以升麻鱉甲湯化裁治療。王雪華等[13]在SLE急性發(fā)作期辨證為熱毒熾盛時(shí)，提出清熱解毒、涼血祛瘀化斑的治法，方用升麻鱉甲湯合犀角地黃湯加減。黃丹云[14]對(duì)溫成平教授治療SLE皮膚損害的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行總結(jié)，溫成平教授治療SLE皮膚損害多用涼血化斑、滋補(bǔ)肝腎、溫經(jīng)通脈等法，活動(dòng)期清熱解毒、涼血化斑；緩解期滋陰清熱、益氣養(yǎng)陰、祛瘀生新。由此可見，多數(shù)醫(yī)家在治療SLE皮膚損害時(shí)均以清熱解毒為總則。

基于復(fù)雜系統(tǒng)熵聚類的組方規(guī)律分析，本研究得到9個(gè)新處方。新處方1包括青蒿、鱉甲、凌霄花、炒槐花，涼血活血、滋陰清熱；新處方2由地骨皮、淡竹葉、天花粉、黃精、胡黃連組成，主要功效是涼血養(yǎng)陰、清熱生津；新處方3是川芎、紅花、桃仁、女貞子、墨旱蓮的組合，主要功效是涼血活血、滋腎祛瘀；新處方4清熱補(bǔ)虛；新處方5清熱涼血解毒；新處方6清熱解毒；新處方7補(bǔ)瀉同用；新處方8涼血活血、清熱滲濕；新處方9清熱涼血、解毒生津。新處方5和9聚為一類，兩方均有牡丹皮、水牛角，相同功效是清熱涼血解毒。新處方3和8皆有涼血活血作用，新處方4和7皆有補(bǔ)益之意，新處方6清熱解毒，五方共同聚為一大類。新處方1涼血活血、滋陰清熱，新處方2涼血養(yǎng)陰、清熱生津，兩者各自聚為一類。整體來看，SLE皮膚損害新處方組合仍是從SLE熱毒瘀虛的病理因素出發(fā)，以清熱涼血解毒治療為主，兼以活血補(bǔ)虛，熱毒瘀去則血熱妄行止，皮膚損害漸消。

進(jìn)一步對(duì)新處方進(jìn)行KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)新處方中的藥物主要涉及鈣信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、膽堿能突觸、HIF-1信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、PI3K-PKB/Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等多條信號(hào)通路。鈣信號(hào)通路是許多信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[15]。HIF-1相關(guān)的靶基因轉(zhuǎn)錄，可促進(jìn)細(xì)胞增殖而抑制細(xì)胞凋亡[16]。HIF-1信號(hào)通路則可通過影響Th17和Treg細(xì)胞的比例，使兩者比例失調(diào)，從而發(fā)生免疫失衡，從而誘導(dǎo)SLE發(fā)病[17]。岑晗[18]從遺傳學(xué)角度表明NF-κB信號(hào)通路與SLE發(fā)生密切相關(guān)。還有研究也表明，NF-κB信號(hào)通路活化異常可能與患者皮膚損害發(fā)生相關(guān)[19-20]。p53基因在外周血T淋巴細(xì)胞中的異常表達(dá)與SLE的發(fā)病相關(guān)[21]。以上通路皆與SLE發(fā)病相關(guān)，新處方可能通過以上通路對(duì)SLE皮膚損害發(fā)揮治療作用。

綜上所述，本文通過數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)SLE皮膚損害整體治則以清熱涼血解毒為主，常配合活血補(bǔ)虛等治法；生物信息學(xué)方法分析表明，其主要通過鈣信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、膽堿能突觸、HIF-1信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、PI3KPKB/Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等發(fā)揮作用。本研究為深入分析驗(yàn)證中醫(yī)藥治療SLE皮膚損害提供了方向，但本研究結(jié)果還需進(jìn)一步通過臨床和基礎(chǔ)研究加以驗(yàn)證。