黃忠興，何慧怡，樊麗娜，勞方業(yè)，吳嘉云，凌秋平，徐苑嫻

(廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業(yè)研究所) 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣東廣州510316)

0 引言

甘蔗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展離不開甘蔗良種，培育抗逆性強的甘蔗良種非常重要。目前推廣的栽培品種在生產(chǎn)過程中存在或多或少的缺點，如抗性(抗旱性、抗除草劑、抗病性、抗寒性等)方面存在一些的問題。抗除草劑作物的廣泛應(yīng)用帶來巨大的農(nóng)業(yè)變革與增產(chǎn)效益[1]。長期以來，甘蔗育種采用常規(guī)雜交育種，需要耗費大量人力、物力和財力，且育種周期長、篩選困難[2]?？萍既招略庐惖臅r代，轉(zhuǎn)基因是改良作物短板最快捷的途徑。但基于目前對轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品因安全性而難以推廣的問題[3]，甘蔗誘變育種是進行甘蔗品種改良的另一快速和有效途徑。在這方面，前人利用化學(xué)誘變[4]和 Co60輻照誘變[5-7]比較多。但這些誘變手段存在一些問題：化學(xué)誘變手段不僅存在處理量小和操作過程中高感染的問題；Co60-γ射線輻射誘變需要特殊的場所和保護措施。而常壓室溫等離子體(Atmospheric and Room Temperature Plasma，ARTP)誘變育種技術(shù)因其放電均勻穩(wěn)定、活性粒子濃度高、操作簡便、誘變快速、環(huán)境友好、對操作者安全、無輻射、操作可控性強等特點，已成為一種應(yīng)用廣泛的、快速高效的新型生物誘變育種方法。目前已成功應(yīng)用于包括細菌、放線菌、真菌、酵母、微藻等在內(nèi)的40余種微生物的誘變育種[8-15]，植物方面在華山松種子誘變方面也有成功的案例[16]。目前國內(nèi)關(guān)于ARTP誘變甘蔗抗性的研究鮮有報道。本研究以甘蔗胚性愈傷組織為試驗材料，利用ARTP對其進行不同時間和草甘膦濃度處理，測定和分析誘變處理后胚性愈傷組織成活率，以期為以后篩選高抗草甘膦甘蔗材料提供理論依據(jù)。探索ARTP誘變甘蔗胚性愈傷組織最佳的處理技術(shù)和方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗材料

試驗處理 3種基因型甘蔗材料：大莖野生種S.robustum Brandes and Jesw. ex GrassⅠ后代(包括ROC22，粵糖94-128)，斑茅E.arundinaceum (Retz.)Jeswit后代(崖城07-71)[17]，割手密S.spontaneum L.后代(包括粵糖 93-159，粵糖 00-236)，均采自廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業(yè)研究所)翁源基地。

1.1.2 試驗儀器

HPD-280型ARTP育種機：南京蘇曼等離子科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 試驗試劑

95%草甘膦原粉：河南今越生物技術(shù)有限公司出品；30% H2O2：消毒用。

1.1.4 試驗培養(yǎng)基制備

愈傷組織啟動培養(yǎng)基CM1：MS培養(yǎng)基+2，4-D 2.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L，pH值6.2。培養(yǎng)皿分裝。

緩沖培養(yǎng)基CM2：MS培養(yǎng)基+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L，pH值6.2。培養(yǎng)皿分裝。

篩選培養(yǎng)基CM3：MS培養(yǎng)基+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L，pH值6.2。玻璃瓶分裝。滅菌后分別加入草甘膦 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μmol/L。

1.2 試驗地點

廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業(yè)研究所)實驗室。

1.3 試驗方法

1.3.1 甘蔗愈傷組織啟動

待蔗莖長出后，割取健壯蔗株尾梢，剝?nèi)ネ獠咳~片，無菌條件下用75%酒精消毒30 s，切除外層和兩端葉片(葉鞘)，留下生長點以上10～50 mm嫩葉(嫩鞘)并切成約2 mm的薄片，接種于培養(yǎng)基CM1中，在 26～28℃黑暗條件下培養(yǎng)，每皿 6～8塊，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，然后繼代 1～2次，每皿 6～8塊，使其產(chǎn)生胚性愈傷組織。

1.3.2 ARTP防菌處理

處理前先盛30% H2O220 mL在培養(yǎng)皿中，放在處理室中，采用抽真空方式進行彌漫消毒。以氮氣作為保護性氣體。

1.3.3 誘變操作處理

取甘蔗胚性愈傷組織(米黃色)約90粒，然后將鋪滿胚性愈傷組織的培養(yǎng)皿上蓋打開，置于處理室正中位置，按照等離子體操作說明進行輻照誘變。處理完后蓋好培養(yǎng)皿上蓋，采用聚乙烯薄膜密封。保護性氣體為氮氣，流量為1.2 L/min，抽真空減壓處理，處理功率取中間值為170 W，處理時間設(shè)0、80、100、120、140、160、180 s。

1.3.4 緩沖培養(yǎng)

處理后的愈傷組織接種在 CM2進行緩沖培養(yǎng)8～10天，每個培養(yǎng)皿接30粒。

1.3.5 草甘膦脅迫篩選

然后將經(jīng)過緩沖培養(yǎng)的胚性愈傷組織接種在含有 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μmol/L濃度梯度草甘膦的培養(yǎng)基CM3上進行篩選，每個培養(yǎng)皿接20粒。共42個處理，各設(shè)3個重復(fù)。篩選時長為7天。

1.3.6 數(shù)據(jù)測定

參照蔡聰[18]記錄各階段甘蔗胚性愈傷組織(米黃色)的活愈數(shù)，并按照下列公式計算活愈率：活愈率=接種后胚性愈傷組織成活數(shù)×100%/接種前胚性愈傷組織數(shù)

1.4 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)經(jīng)整理后，利用 Excel 2007和 DPS 7.05軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變處理后各基因型材料的活愈率

不同基因型甘蔗胚性愈傷組織經(jīng)過ARTP誘變處理80～180 s后，接種在含草甘膦0～2.5 μmol/L濃度梯度的篩選培養(yǎng)基 CM3上，30天后統(tǒng)計活愈率。測定結(jié)果見表1和圖1。

由表1可知，不同基因型甘蔗胚性愈傷組織的平均活愈率存在一定的差異。含割手密血緣后代材料和大莖野生種血緣后代材料的平均活愈率分別是17.7%和 16.1%，且顯著低于含斑茅血緣后代材料(27.2%)。根據(jù)杜丹清等[19]、馬娜娜等[20]的誘變理論研究，80%～90%的致死率有利于正突變體的產(chǎn)生。甘蔗胚性愈傷組織與微生物都是有生命的物質(zhì)，對輻射誘變感應(yīng)具有相似性，即經(jīng)處理后活愈率偏低(10%～20%)的甘蔗胚性愈傷組織細胞內(nèi)的 SOS修復(fù)機制的容錯率比較高，最易產(chǎn)生正突變。因此，選取含割手密血緣后代材料和含大莖野生種血緣后代材料來誘變比較合適。

表1 不同基因型甘蔗胚性愈傷組織的平均活愈率

2.2 ARTP誘變時間的選擇

圖1 不同基因型甘蔗胚性愈傷組織不同時間處理下和草甘膦濃度梯度篩選下的活愈率

從表 2、圖 2可以看出，隨著誘變處理時間的增加，胚性愈傷組織活愈率越來越低，當(dāng)誘變處理時間在120 s時，3種基因型甘蔗的致死率一致達到80%以上。因此，誘變時間最合適的是 120 s。在140～160 s區(qū)間內(nèi)，割手密、大莖野生種的材料致死率仍在85%以上，這個時間階段仍可選擇性地加以利用。

2.3 ARTP誘變后接種培養(yǎng)基中草甘膦濃度的選擇

從表 3、圖 3可以看出，隨著草甘膦濃度梯度增加，接種的胚性愈傷組織活愈率越來越低，當(dāng)草甘膦濃度在1.5 μmol/L時，3種基因型甘蔗的致死率首次一致達到 80%以上(即活愈率 20%以下)，當(dāng)草甘膦濃度2.5 μmol/L時，含斑茅血緣后代材料和割手密后代材料的致死率仍在 80%～90%。因此，為篩選到抗性強的材料，誘變后的愈傷組織可接種在含草甘膦1.5 μmol/L的培養(yǎng)基上進行首次篩選，一周后再轉(zhuǎn)接到2.5 μmol/L草甘膦培養(yǎng)基上進行第2次篩選。

表2 不同基因型甘蔗胚性愈傷組織在不同時間誘變處理下的活愈率 單位：%

圖2 不同基因型甘蔗胚性愈傷組織隨著誘變時間增長的成活率變化圖

表3 不同基因型甘蔗胚性愈傷組織在不同草甘膦濃度篩選處理下的活愈率 單位：%

圖3 不同基因型甘蔗胚性愈傷組織在草甘膦濃度梯度篩選下的成活率變化圖

3 結(jié)論與討論

ARTP誘變技術(shù)作為一種新型誘變技術(shù)，具有誘變溫度低、與細胞作用明顯、高活性離子體射流均勻等特點，與傳統(tǒng)的物理誘變技術(shù)相比較易操作，安全性高且無污染[21]。ARTP具有操作簡易、成本低、與生物大分子和細胞作用明顯等優(yōu)點，已成為快速突變微生物基因組的有效方法[22-24]。艾江寧等[25]用ARTP對湛江等鞭金藻進行誘變，以致死率99%的條件進行誘變，每次誘變時間 25 s。由于誘變后還要進行除草劑的篩選，本研究以致死率80%～90%的條件進行誘變選擇，結(jié)果表明：取含割手密血緣的后代材料和含大莖野生種血緣的后代材料來誘變的突變率高；ARTP每次誘變最合適時間是120 s，這個時間與曹茜、馮鳳琴研究的誘變時間一致[26]。

為減少篩選的工作量，本研究對起定向篩選作用的草甘膦用量作了探索。結(jié)果表明：二步篩選是比較可靠。即誘變后的胚性愈傷組織首先接種在含有1.5 μmol/L草甘膦的培養(yǎng)基上，7天后再接種在含有2.5 μmol/L草甘膦的培養(yǎng)基上進行篩選，以逐漸提高胚性愈傷組織對草甘膦的抗性。

本研究只是對甘蔗胚性愈傷組織抗性篩選的前期研究，后續(xù)還要對具有抗性的胚性愈傷組織分化做進一步研究。