涂東堃 - 魯 悅 鄭曉亮 - 黃敏麗 - 王奕婧 - 曾紹校,2,3 -,2,3 徐 暉,2,3 ,2,3

(1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.閩臺(tái)特色海洋食品加工及營養(yǎng)健康教育部工程研究中心，福建 福州 350002；3.福建省特種淀粉品質(zhì)科學(xué)與加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

鎘是一種有毒的重金屬元素，長期暴露在鎘污染的環(huán)境中會(huì)對(duì)人的腎臟、肺、骨骼造成損傷，嚴(yán)重的還會(huì)致癌[1-3]。中國鎘離子在環(huán)境、糧食乃至食品的污染情況也不容樂觀，Wei等[4]對(duì)北京人口密度高的交通區(qū)、居民區(qū)的街道粉塵進(jìn)行采樣，測(cè)定結(jié)果表明鎘的含量處于重度污染。陸素芬等[5]研究了南丹縣糧食作物玉米中重金屬離子的含量，結(jié)果表明鎘離子的超標(biāo)率為8.4%，在鎘的影響下玉米中蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪含量均會(huì)發(fā)生變化。李穎等[6]對(duì)邯鄲市某冶煉廠周邊的小麥進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明小麥中鎘離子和鉛離子的含量均有超標(biāo)的情況。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)已將鎘離子分類為第一類致癌物質(zhì)[7]，中國生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定飲用水中鎘的限量標(biāo)準(zhǔn)為5 ng/kg，食品污染物限量標(biāo)準(zhǔn)中大米中鎘的限量標(biāo)準(zhǔn)為0.2 mg/kg。綜合以上原因，對(duì)環(huán)境和食品中的鎘離子進(jìn)行監(jiān)測(cè)和控制具有十分重要的意義。

傳統(tǒng)的鎘離子檢測(cè)方法有原子吸收光譜法[8]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[9]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜分析[10]、原子熒光光譜法[11]。這些檢測(cè)方法是相對(duì)較為成熟的方法，能夠?qū)Νh(huán)境中的鎘離子進(jìn)行有效的分析，靈敏度、準(zhǔn)確性、選擇性都比較好，但這些方法一般都要求有大型的儀器設(shè)備，專業(yè)的操作人員，檢測(cè)成本高，檢測(cè)過程繁瑣。

近些年，許多學(xué)者對(duì)環(huán)境和食品中重金屬殘留快速檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了研究，其中主要有電化學(xué)法[12]、比色法[13]、試紙條方法[14]等。Si等[12]研制了一種基于還原氧化石墨烯(rGO)/金納米顆粒(AuNPs)/四苯基卟啉(TPP)(rGO/AuNPs/TPP)納米共軛物的電化學(xué)傳感器，通過TPP對(duì)Cd2+的選擇性富集，以及rGO對(duì)Cd2+與卟啉衍生物配位作用的加強(qiáng)，對(duì)鎘離子進(jìn)行定量檢測(cè)。Guo等[13]利用Cd2+與四分子的谷胱甘肽(GSH)形成球形復(fù)合物的原理，研制出了一種基于GSH保護(hù)的納米金比色傳感器，并對(duì)水樣和消化后的大米樣品中的Cd2+進(jìn)行檢測(cè)。Xiao等[14]研制了一種基于金納米星和量子點(diǎn)的集成免疫層析試紙條，對(duì)Cd2+進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)線達(dá)到0.18 ng/mL，線性范圍為0.25～8.00 ng/mL。這些方法具有方便、簡單、快捷等特點(diǎn)，但部分方法準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性較差，需要對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)。

核酸適配體是能夠特異性識(shí)別靶標(biāo)分子具有較高親和力的一類RNA或DNA分子，其識(shí)別靶分子的機(jī)理與抗原抗體相似，具有穩(wěn)定性好、易于合成和修飾等優(yōu)點(diǎn)[15]。近年發(fā)展起來的基于核酸適配體的檢測(cè)方法食源性致病菌、生物毒素、重金屬、藥物殘留檢測(cè)等領(lǐng)域顯示了良好的應(yīng)用前景[16]。Bayramoglu等[17]通過磁捕獲和基于適配體的親和力對(duì)牛奶樣品中沙門氏菌的病原體細(xì)胞進(jìn)行快速檢測(cè)，在沒有任何培養(yǎng)的情況下，在低至103CFU/mL的牛奶樣品中實(shí)現(xiàn)了沙門氏菌的檢測(cè)。核酸適配體能對(duì)一些小分子物質(zhì)進(jìn)行識(shí)別，如重金屬等。Wu等[18]通過固定寡核苷酸鏈庫，建立了一種新方法進(jìn)而篩選出了鎘離子核酸適配體。目前，用該核酸適配體對(duì)鎘離子進(jìn)行檢測(cè)的研究比較少[19]。

噻唑橙(TO)是一種不對(duì)稱的花菁類陽離子染料，用作熒光檢測(cè)時(shí)可消除染料自身的背景干擾，提高熒光檢測(cè)靈敏度，是一種流行的核酸熒光探針，廣泛運(yùn)用于檢測(cè)不同的DNA和RNA結(jié)構(gòu)[20]。Kang等[21]研制了一種基于噻唑橙和i-motif DNA構(gòu)象改變的傳感器，用于檢測(cè)Ag+。

試驗(yàn)擬基于鎘離子核酸適配體和噻唑橙染料構(gòu)建一種鎘離子檢測(cè)的熒光方法，以期為核酸適配體在鎘離子快速檢測(cè)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

噻唑橙：90%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

二甲基亞砜：頂空氣相色譜級(jí)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

乙醇、CdCl2·H2O、FeCl3·H2O、BaCl2·H2O、CaCl2等：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

HEPES：1 mol/L，北京索萊寶生物科技有限公司；

磷酸鹽緩沖溶液：1 mol/L，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

超純水：18.2 mΩ，由Millipore凈水系統(tǒng)制備；

鎘離子適配體：5’-GGACTGTTGTGGTATTATTTTTGGTTGTGC-SH-3’，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：SQP型，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；

渦旋振蕩器：MS 3 basic型，廈門精藝興業(yè)科技有限公司；

pH計(jì)：ST3100型，奧豪斯儀器(常州)有限公司；

超純水機(jī)：UV 24型，廈門精藝興業(yè)科技有限公司；

冷凍離心機(jī)：UNIVERSAL 320R型，德國Hettich科學(xué)儀器公司；

超聲波清洗機(jī)：KQ5200E型，昆山舒美超聲儀器有限公司；

熒光分光光度計(jì)：RF-5301PC型，日本島津公司；

石墨爐原子吸收分光光度計(jì)：AA-6300C型，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 鎘離子熒光檢測(cè) 在EP管中加入35 μL的100 mmol/L HEPES溶液，同時(shí)加入25 μL 2 μmol/L的核酸適配體，再加入鎘離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，控制反應(yīng)體系酸度pH=7.0，充分混合，室溫下反應(yīng)80 min；在上一步的混合溶液中加入60 μL 4 μmol/L 噻唑橙溶液充分振蕩，用超純水定容至200 μL，繼續(xù)在室溫下反應(yīng)25 min，同時(shí)配制空白。將混合的溶液轉(zhuǎn)移至超微量熒光比色皿中，用分光光度計(jì)記錄500～630 nm內(nèi)的熒光光譜，分別測(cè)定溶液熒光強(qiáng)度F和空白值F0。

1.2.2 體系pH值優(yōu)化 在EP管中加入核酸適配體和噻唑橙溶液充分振蕩，加入相同量的不同pH的磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L)，控制pH為3～9，加超純水至總體積為200 μL，室溫下反應(yīng)25 min，測(cè)定不同pH下的熒光強(qiáng)度。

1.2.3 噻唑橙—適配體濃度比的優(yōu)化 固定噻唑橙與適配體混合物的總體積，加入不同體積的噻唑橙與適配體，使其摩爾比分別為9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9，加入35 μL 100 mmol/L的HEPES溶液，定容，pH值控制為7，室溫下反應(yīng)25 min，測(cè)定體系熒光強(qiáng)度。

1.2.4 噻唑橙與適配體結(jié)合時(shí)間的優(yōu)化 在EP管中加入相同核酸適配體，加入適當(dāng)?shù)泥邕虺热芤菏蛊淠柋葹?∶3，加入35 μL 100 mmol/L的HEPES溶液，控制溶液pH為7，加超純水至總體積200 μL，選擇不同的時(shí)間點(diǎn)測(cè)體系的熒光強(qiáng)度。

1.2.5 適配體與鎘離子結(jié)合時(shí)間的優(yōu)化 向一系列EP管中加入相同的核酸適配體和鎘離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，常溫下分別反應(yīng)0，10，20，30，40，50，60 min，加入相同量的噻唑橙溶液，使噻唑橙與適配體濃度比為7∶3，加入35 μL 100 mmol/L的HEPES溶液，定容，室溫下反應(yīng)25 min，測(cè)定體系熒光強(qiáng)度。

1.2.6 熒光檢測(cè)的特異性 向不同的EP管中加入等量的核酸適配體，加入35 μL HEPES溶液使體系pH為7，分別加入50 ng/mL的8種不同的金屬離子(鉀、鈣、鎂、鋅、鐵、銅、鉛、鉻)和鎘離子混合均勻，常溫下反應(yīng)20 min，再加入等量噻唑橙溶液使噻唑橙與適配體濃度比為7∶3，繼續(xù)反應(yīng)15 min，測(cè)定熒光強(qiáng)度，并與空白相比較。

1.2.7 實(shí)際樣品前處理 用試驗(yàn)建立的方法對(duì)水樣A、B、C中的重金屬鎘離子含量進(jìn)行檢測(cè)分析。將水樣用0.2 mm注射過濾器對(duì)水樣品進(jìn)行過濾，添加2 ng/mL濃度的鎘離子標(biāo)品，用試驗(yàn)建立的方法檢測(cè)，測(cè)得鎘離子的濃度值并計(jì)算回收率，與石墨爐原子吸收光譜進(jìn)行比較。

1.2.8 石墨爐原子吸收光譜法檢測(cè) 將水樣放置于自動(dòng)進(jìn)樣器中，調(diào)整自動(dòng)進(jìn)樣器與石墨管的距離，設(shè)置試驗(yàn)參數(shù)分別為進(jìn)樣體積10 μL，波長228.8 nm，電流4 mA等，隨后開始進(jìn)行水樣中鎘的檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘離子熒光檢測(cè)設(shè)計(jì)原理

如圖1所示，當(dāng)噻唑橙溶液在485 nm的激發(fā)光下，在510～610 nm的范圍內(nèi)沒有發(fā)射峰；當(dāng)噻唑橙與適配體結(jié)合后，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，在535 nm處出現(xiàn)峰值；當(dāng)有鎘離子存在時(shí)，體系熒光強(qiáng)度降低。噻唑橙在游離狀態(tài)下，熒光產(chǎn)率低，與適配體結(jié)合后，通過插入堿基對(duì)、與帶負(fù)電的磷酸骨架結(jié)合或與小溝槽結(jié)合而產(chǎn)生熒光效應(yīng)[22]，當(dāng)有Cd2+存在時(shí)，適配體優(yōu)先與Cd2+結(jié)合，阻礙噻唑橙與適配體的結(jié)合，熒光強(qiáng)度降低。

圖1 鎘離子檢測(cè)熒光光譜圖

Figure 1 Fluorescence spectrogram of cadmium ion detection

2.2 體系pH對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

由圖2可知，pH在3～4時(shí)檢測(cè)體系的熒光值隨pH的升高而升高，當(dāng)pH>4時(shí)，隨著pH的升高而降低，當(dāng)pH=4時(shí)熒光值最大。該結(jié)果與Kang等[21]的試驗(yàn)結(jié)果一致，在酸性條件下噻唑橙與適配體結(jié)合產(chǎn)生的熒光較中性及堿性條件下大。體系pH>7時(shí)，熒光強(qiáng)度變化小，比在酸性條件下更為穩(wěn)定，因此檢測(cè)鎘離子的最佳pH值為7。

圖2 溶液pH對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

2.3 噻唑橙與適配體濃度比對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

由圖3可知，體系在最大發(fā)射波長的熒光強(qiáng)度隨噻唑橙與適配體的濃度比增加先升高后降低，當(dāng)噻唑橙與適配體的比值為7∶3時(shí)熒光強(qiáng)度最大。噻唑橙與適配體的濃度比對(duì)熒光強(qiáng)度起著重要作用，濃度比太低時(shí)，核酸濃度低產(chǎn)生的噻唑橙—適配體復(fù)合物濃度低，熒光強(qiáng)度弱；濃度比高時(shí)，適配體濃度大，影響熒光檢測(cè)的靈敏度。當(dāng)噻唑橙與適配體處于7∶3的比值時(shí)，熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，適配體濃度約為0.46 μmol/L，與Sun等[23]采用的適配體濃度相近。因此試驗(yàn)中以7∶3作為噻唑橙與適配體的最佳摩爾比。

2.4 噻唑橙與適配體結(jié)合時(shí)間的優(yōu)化

如圖4所示，體系的熒光強(qiáng)度在10 min以內(nèi)迅速增加，在10～15 min時(shí)熒光增強(qiáng)速度變緩，15 min后混合液的熒光強(qiáng)度基本保持不變，此時(shí)適配體與噻唑橙充分反應(yīng)，熒光強(qiáng)度達(dá)最大值。噻唑橙與適配體結(jié)合的時(shí)間對(duì)熒光產(chǎn)率的影響是很重要的因素[24]，反應(yīng)時(shí)間太短，噻唑橙與適配體結(jié)合不夠完全，熒光信號(hào)未達(dá)到穩(wěn)定，所以試驗(yàn)中以15 min作為噻唑橙與適配體反應(yīng)的最佳反應(yīng)時(shí)間。

圖3 噻唑橙與適配體濃度比對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

Figure 3 Effect of concentration ratio of TO and Apta-mer on fluorescence intensity

圖4 噻唑橙與適配體結(jié)合時(shí)間的優(yōu)化

2.5 適配體與鎘離子反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

如圖5所示，隨著孵育時(shí)間的增加，熒光差值(F-F0)增大，當(dāng)孵育時(shí)間>20 min時(shí)，熒光差值保持穩(wěn)定無變化，此時(shí)溶液中鎘離子與適配體反應(yīng)充分，熒光強(qiáng)度不再降低。若適配體與鎘離子反應(yīng)時(shí)間不足，體系未達(dá)到平衡，將影響檢測(cè)結(jié)果。為此，選擇20 min為適配體與靶標(biāo)物質(zhì)鎘離子的最佳孵育時(shí)間。

2.6 檢出限與線性范圍

在最佳的試驗(yàn)條件下，用試驗(yàn)建立的方法對(duì)不同濃度的鎘離子標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)鎘離子濃度與體系的熒光強(qiáng)度在2.00～80.00 ng/mL的范圍內(nèi)呈良好的線性(見圖6)，校正曲線方程y=-2.340 6x+284.73，檢出限為0.23 ng/mL,與Zhu等[25]通過對(duì)適配體修飾檢測(cè)的方法相比較，檢出限接近，但試驗(yàn)建立的方法不需要對(duì)適配體進(jìn)行修飾，只需簡單的混合，操作方便，而且線性范圍較廣。

圖5 適配體與鎘離子反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

Figure 5 Optimization of reaction time between Aptamer and cadmium ions

圖6 熒光強(qiáng)度與鎘離子的線性關(guān)系圖

Figure 6 Linear relationship between fluorescence intensity and cadmium ion

圖7 選擇性分析

2.7 特異性

選擇了8種不同的金屬離子(鉀、鈣、鎂、鋅、鐵銅、鉛、鉻)與鎘離子在最優(yōu)試驗(yàn)條件下進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖7所示。與其他金屬離子相比，加入鎘離子的體系熒光差值最大，熒光強(qiáng)度變化(ΔF)明顯，Mg2+等對(duì)Cd2+的檢測(cè)有一定的影響，加入Mg2+和Pb2+的檢測(cè)體系也引起了不可忽視的熒光強(qiáng)度變化，與Wu等[18]的研究結(jié)果相似。除Mg2+與Pb2+外，試驗(yàn)建立的方法具有較好的特異性。為了提高方法的選擇性，Cao等[26]通過使用螯合劑的策略掩蓋部分離子，在后續(xù)的研究中可以利用螯合劑(如：PDCA和NTA等)降低Pb2+、Mg2+對(duì)熒光檢測(cè)的影響。

2.8 實(shí)際樣品檢測(cè)

用試驗(yàn)建立的方法對(duì)3種不同的水樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，將所得的結(jié)果與石墨爐原子吸收光譜法相比較(GB 5009.15—2014)。經(jīng)檢測(cè)未加標(biāo)的水樣品中本底值分別為3.082 2，3.568 4，2.646 4 ng/mL，扣除本底值所得的結(jié)果見表1。

由表1可知，試驗(yàn)建立的方法檢測(cè)實(shí)際樣品所得結(jié)果與原子吸收光譜法相比較差異小，有較好的回收率，且具有較好的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，表明所建方法可用于鎘離子的實(shí)際樣品檢測(cè)。

表1 鎘離子加標(biāo)回收率

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了一種基于鎘離子核酸適配體無標(biāo)記檢測(cè)鎘離子的熒光方法，其最佳熒光檢測(cè)條件為：pH值7、噻唑橙—適配體濃度比7∶3、噻唑橙與適配體結(jié)合時(shí)間15 min、適配體與鎘離子結(jié)合時(shí)間20 min。在此條件下，熒光強(qiáng)度與鎘離子濃度表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，線性范圍為2.00～80.00 ng/mL，檢測(cè)限為0.23 ng/mL，但對(duì)鎘離子檢測(cè)的特異性還有待加強(qiáng)，后續(xù)研究可通過對(duì)干擾離子進(jìn)行屏蔽或者信號(hào)擴(kuò)增等方法增強(qiáng)。